Микро-механические характеристики легочной ткани с помощью атомно-силовой микроскопии

Общая цель следующего эксперимента заключается в характеристике локального механического окружения паренхимы легкого в пространственном масштабе, соответствующем резидентным клеткам, путем прямого измерения локальных упругих свойств свежей ткани легкого с помощью микроиндентации методом атомно-силовой микроскопии. Для этого ткань легкого мыши, раздутую агаром, разрезают лезвием бритвы или скальпелем для подготовки полосок паренхимы легкого размером 5 × 5 мм в длину и ширину и толщиной 400 µm. Затем нефиксированные и непермеабилизированные полоски ткани легкого подвергаются иммуноокрашиванию для определения областей интереса для микроиндентации методом АСМ.

Затем проводят микроиндентирование методом FM на полосках ткани в PBS при комнатной температуре. Это позволяет напрямую измерить локальные упругие свойства свежей легочной ткани. Полученные результаты демонстрируют выраженные различия в диапазоне и распределении жесткости тканей в нормальной и фиброзной паренхиме легких, а также значительные пространственные вариации жесткости, особенно в образце фиброзного легкого.

На основе карт жесткости, полученных из кривых принудительного смещения с помощью микроиндентации FM. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами измерения, такими как растяжение полосок ткани, является беспрецедентное пространственное разрешение, обеспечивающее уникальную возможность анализа вариаций жесткости ткани на микромасштабном уровне. Данный метод измерения позволяет ответить на ключевые вопросы, например, о том, как жесткость распределяется в пространстве внутри ткани, а также каковы масштаб и пространственные границы изменений жесткости при заболевании.

Процессы, приводящие к ремоделированию тканей. Чтобы подготовить полоски легочной ткани, начните со стабилизации структуры легкого для разрезания путем раздувания изолированных легких мыши. Введите интратрахеально 50 milliliters per kilogram массы тела теплого 2% раствора agarose с низкой температурой гелеобразования, приготовленного в PBS, перевяжите трахею и охладите раздутые легкие в ванне с PBS при температуре 4 °C в течение 60 минут. Agarose превратится в гель и затвердеет в воздушных пространствах, обеспечивая бережную стабилизацию структуры легкого. В течение этого интервала, используя бритву или скальпель, разрежьте стабилизированную agarose ткань легкого мыши на полоски длиной и шириной примерно 5 by 5 millimeters и толщиной 400 micrometers.

Затем промойте полоски в PBS при 37 °C в течение пяти минут, чтобы удалить остатки aros для исключения крупных дыхательных путей и сосудов. Вырежьте полоски из субплевральных областей, удаленных от главных бронхов; если планируется визуализировать дыхательные пути или крупные сосуды, вырежьте полоски из легочной ткани, расположенной проксимальнее главных бронхов, чтобы выделить области интереса для микроиндентации FM. Визуализируйте ткань с помощью фазово-контрастной микроскопии или проведите иммуноокрашивание с последующей визуализацией с помощью флуоресцентной микроскопии.

Описание процедуры приведено в текстовой части данного протокола. Непосредственно перед проведением FM-характеристики закрепите полоски ткани на покровных стеклах размером 15 мм, покрытых поли-L-лизином, приподняв покровное стекло снизу под плавающей тканью; при этом убедитесь, что полоска ткани равномерно распределилась по поверхности стекла. При необходимости прижмите полоску вторым чистым непокрытым покровным стеклом, приложив легкое давление для лучшего прикрепления ткани к стеклу, покрытому поли-L-лизином.

Калибруйте систему АСМ в соответствии с инструкциями производителя непосредственно перед каждым раундом экспериментов по микроиндентированию. Для этого определите два критических параметра: константу жесткости кантилевера методом тепловых флуктуаций на воздухе и чувствительность отклонения кантилевера — параметр, используемый для масштабирования выходного сигнала фотодиода до фактического расстояния отклонения кантилевера.

Откалибруйте чувствительность отклонения, получив стандартную кривую принудительного смещения в PBS на чистом предметном стекле. Затем рассчитайте наклон кривой принудительного смещения при измерении этой кривой. Зонд А FM перемещают к поверхности образца и обратно в одной точке, при этом отклонение кантилевера delta D отслеживается как функция смещения зонда delta Z. Рекомендуется использовать треугольный кантилевер из нитрида кремния с силикатным сферическим наконечником диаметром 5 µm от компании FM probes с константой жесткости 0.06 N/m.

Мы провели механическую характеристику мягких материалов с модулем сдвига в диапазоне от 100 до 50 000 паскалей. Протрите нижнюю поверхность покровного стекла образца салфеткой, затем закрепите его на стандартном предметном стекле с помощью вакуумной смазки. Установите предметное стекло на столик для образцов АFM и залейте образец 500 microliters PBS комнатной температуры.

Затем поместите сканирующую головку A FM над образцом. Отрегулируйте предметный столик микроскопа, настроив его для наблюдения через окуляры, чтобы совместить зонд A FM с центром поля зрения. Перемещайте предметный столик A FM, чтобы выбрать интересующую область на ткани.

Затем переключитесь на просмотр через ПЗС-камеру для записи фазово-контрастного изображения и/или флуоресцентных изображений ткани по мере необходимости. Медленно перемещайте зонд A FM вниз до точного контакта с образцом. Для характеристики мягких образцов методом микроиндентирования A FM требуются малые глубины вдавливания, чтобы избежать значительных локальных деформаций, которые делают неприменимой модель Герца, используемую для расчета модуля упругости. Чтобы избежать больших деформаций, выполняйте индентирование в триггерном режиме, установив максимальный прогиб кантилевера на 500 nanometers.

Данный предел прогиба ограничит максимальную силу индентирования значением менее 30 nano newtons. Скорость индентирования должна быть достаточно низкой, чтобы исследовать упругие, а не вязкоупругие свойства мягкого образца. Для одиночного измерения в интересующей области ткани легкого выберите диапазон скоростей от 2 до 20 micrometers per second.

Переместите зонд АСМ в интересующую область и выполните однократное вдавливание для получения стандартной кривой зависимости силы от смещения. Зонд будет перемещаться только в направлении Z. Для автоматического картирования интересующей области переключитесь в режим картирования сил, выберите размер сканирования и количество точек выборки в пределах выбранной области.

Зонд АСМ сканирует поверхность образца между перемещениями при индентировании и собирает отдельные кривые зависимости силы от смещения в каждой точке заданной сетки образца. Мы сочли целесообразным использовать сетку размером 16 на 16 точек для картирования области 80 мкм на 80 мкм при скорости индентирования 20 мкм/с, что занимает около 10 минут. Для расчета модуля Юнга кривая зависимости силы от смещения аппроксимируется по модели сферического индентирования Герца с использованием нелинейной регрессии методом наименьших квадратов, как показано здесь, где F равно K sub C умноженное на delta D — сила изгиба кантилевера.

K sub C — это константа жесткости кантилевера. R — радиус сферического наконечника, delta, которая равна delta Z минус delta D, представляет собой глубину индентации, а new — коэффициент Пуассона образца, который для легочной ткани равен 0.4. Для оценки качества аппроксимации при нелинейной подгонке кривой рассчитайте значение SSR или сумму квадратов разностей между экспериментальными данными и значениями аппроксимации.

Исключите недостоверные или неинтерпретируемые измерения, отбраковав данные кривых с высокими значениями SSR. При необходимости пересчитайте модуль упругости E в модуль сдвига G, используя соотношение E = 2G(1 + ν). Для визуализации пространственного распределения жесткости, полученного в режиме картирования сил, постройте графики данных модуля и контурные карты, например, в виде сетки 16 на 16, охватывающей область размером 80 µm на 80 µm.

Для обработки большого объема данных кривых силы можно написать специальный алгоритм для автоматической аппроксимации кривых зависимости силы от смещения, извлечения модуля упругости и/или построения контурных карт или графиков ELA. При использовании тех же процедур и параметров, что описаны выше, на данном рисунке показано, что ткань была надлежащим образом разрезана и окрашена. Микроструктура альвеол легочной паренхимы хорошо сохранена, что подтверждается иммунофлуоресцентным окрашиванием на ламинин — компонент базальной мембраны — без применения фиксации или пермеабилизации.

На этих панелях показано иммунофлуоресцентное окрашивание на коллаген в свежих нефиксированных легких, полученных от мышей, которым предварительно вводили PBS или блеомицин для индукции фиброза. Здесь представлены примеры графиков зависимости перемещения от силы, полученных с помощью микроиндентирования АСМ при одной и той же приложенной силе. Зонд АСМ создает глубокий отпечаток в мягкой области, что приводит к относительно пологой кривой зависимости перемещения от силы (показана синим цветом), в то время как в более жесткой области наблюдается малый отпечаток и крутая кривая зависимости перемещения от силы (показана красным цветом).

Для получения чистых кривых силы после каждого индентирования кончик А FM необходимо полностью отвести от поверхности образца, чтобы обеспечить отсутствие контакта перед следующим индентированием. Это бесконтактное состояние соответствует плоскому участку кривой, на котором кончик перемещается без изгиба кантилевера. На данном рисунке показана типичная ложная кривая без плоского участка, которая возникает, если кончик не был полностью отведен от поверхности образца (например, при прилипании мягкого образца к кончику), что делает определение точки контакта невозможным, если кончик полностью застрял в мягком образце.

Кривая может выглядеть подобным образом, без четкого отклонения, но с небольшим шумом. На данном рисунке показана жесткость. Данные, извлеченные из кривых принудительного смещения и представленные пространственно в виде карт жесткости, называемых ELAs graft, где цвет соответствует значению жесткости; ELAs graft демонстрируют разительные различия в диапазоне и распределении жесткости тканей в нормальной и фиброзной паренхиме легких, а также значительные пространственные вариации жесткости, особенно в образце легкого с фиброзом.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как охарактеризовать локальную механическую среду паренхимы легких путем прямого измерения локальных упругих свойств свежей ткани легкого с помощью атомно-силовой микроскопии.