Подготовка Synaptoneurosomes от мыши Cortex использовании разрывных Перколла-Сахароза градиента плотности

Общая цель данной процедуры — подготовить трансляционно активные синаптоневрозоны из коры головного мозга мыши, используя дискретный градиент плотности сахарозы. Это достигается путем предварительного сбора и гомогенизации коры головного мозга мыши с последующим центрифугированием гомогената. Затем гомогенат после центрифугирования, или супернатант, наносят на предварительно подготовленные градиенты сахарозы.

Заключительным этапом является центрифугирование и сбор фракции синаптосом. В конечном итоге вестерн-блот-анализ и эксперименты по включению S 35 метионина показывают, что фракция синаптосом обогащена синаптическими компонентами и трансляционно активна. Основными преимуществами данного метода перед существующими способами, такими как центрифугирование и фильтрация, являются, во-первых, отсутствие механических повреждений благодаря использованию градиентов плотности и, во-вторых, низкая токсичность перколла по отношению к клеткам и их компонентам.

Как правило, лица, впервые использующие данный метод, могут столкнуться с трудностями при выполнении этого протокола, так как ключевую роль играет соблюдение временных интервалов. После сбора коры процедуру следует завершить максимально быстро. Чтобы начать процедуру, подготовьте градиентные слои 3, 10, 15 и 23%, добавив соответствующие количества SIP в буфер GM, как описано в сопровождающей статье, и тщательно перемешав.

Подготовьте градиентные слои, перенося по два миллилитра каждого из трех изосмотических растворов перолла с концентрацией 15%, 10% и 3% в центрифужные пробирки Beckman с крышками. При использовании пипетки P 1000 граница между слоями должна быть четко видна, без перемешивания слоев. Храните градиенты при температуре четырех градусов Цельсия не менее 20 минут перед использованием.

Перед началом данной процедуры подготовьте остальные необходимые растворы, как описано в сопроводительной статье. Эвтаназируйте мышь в возрасте от P 13 до P 21 и подготовьте ее к диссекции, распылив 70% ethanol на область затылка и головы. Затем с помощью острых ножниц перережьте спинной мозг у основания черепа.

Затем удалите кожу с верхней части черепа. Сделайте латеральные разрезы черепа между теменной костью и межтеменной костью или между областями головного мозга и коры. После этого разрежьте череп от основания до носа вдоль сагиттального шва.

На этом этапе осторожно удалите размягченную теменную кость, раздвигая каждое полушарие в сторону. После этого введите шпатель в мозг над мозжечком, чтобы извлечь кору. Поместите её в ледяной буфер GM и повторите процедуру для сбора дополнительных образцов коры.

Теперь промойте кору в ледяном буфере GM. Затем перенесите два образца коры в гомогенизатор с застекленным дном, содержащий пять миллилитров холодного буфера GM. Осторожно гомогенизируйте кору, совершив от пяти до 10 движений пестиком A (свободным пестиком), после чего сделайте от пяти до 10 движений пестиком B (плотно прилегающим пестиком).

Количество циклов гомогенизации зависит от конкретной модели гомогенизатора. Перенесите гомогенат в коническую пробирку объемом 15 milliliter. Центрифугируйте при 1000 ×g.

Центрифугируйте при g в течение 10 минут при температуре 4 °C в центрифуге Allegra 6 KR для осаждения клеточного дебриса и ядер. Нанесите по 2 мл супернатанта на каждый градиент перхлората или сахарозы (по одному градиенту на каждую целую кору) и закройте пробирки крышками. Затем центрифугируйте их в роторе с фиксированным углом при 32 500 ×g в течение 5 минут при температуре 4 °C в центрифуге Beckman J 2 21.

После завершения процесса с использованием соответствующих адаптеров в градиенте должна появиться четкая полоса SN; с помощью пипетки отсосите и удалите раствор, находящийся выше полосы SN. Используя стеклянную пастернаковскую пипетку, соберите полосу SN на границе раздела 15–23%; один градиент обычно дает примерно 0,9–1,1 мл SN. После этого перенесите полученный объем в коническую пробирку и храните на льду.

Затем отрегулируйте концентрацию соли в SNS, добавив 1/10 объема 10-кратного стимулирующего буфера. При необходимости добавьте хлорид кальция в 1000-кратной концентрации, чтобы конечная концентрация составила 12 nM. Далее добавьте стоковый раствор TTX в концентрации 1 mM до конечной концентрации 1 µM для подавления неспецифического возбуждения.

Следующим этапом является использование супернатанта (SNS) в соответствующем последующем анализе, например, при изучении трансляции белков. Для других целей лизат супернатанта можно очистить или сконцентрировать с помощью набора Pierce SDS page sample prep kit. Концентрацию белка в SNS можно определить с помощью набора micro BCA protein assay kit.

Ниже представлен пример шести полос или фракций. При гомогенизации коры головного мозга мыши и разделении на прерывистых градиентах сахарозы Perol обогащенные синаптосомы (SNS) содержались в полосе 5 на границе 23–15%; эта полоса была удалена и исследована с помощью электронной микроскопии. Здесь на вестерн-блоттинге показан пример интактных синаптических везикул и сохранности пресинаптических и постсинаптических элементов.

Увеличение содержания синаптических маркеров и снижение количества примесей в полосе SN, полученной при помощи прерывистого градиента сахарозы, подтверждают, что усиление включения S 35 метионина при добавлении глутамата обусловлено синтезом белка de novo. Был добавлен анизомицин (ингибитор синтеза белка) в концентрации 40 micromolar. На данном рисунке показано значительное снижение включения S 35 метионина в присутствии анизомицина с добавлением глутамата или без него по сравнению с базовыми уровнями.

Таким образом, разрывные градиенты сахарозы Percoll позволяют быстро получить высокоактивные и относительно чистые SNS, которые могут быть использованы для изучения трансляции белков. На этом рисунке показано, что пятая фракция разрывного градиента сахарозы Percoll содержит наивысшие уровни синтеза белков de novo. Сравнение показывает, что SNS, полученные путем пропускания гомогенизата коры через серию фильтров с уменьшающимся размером пор с последующим центрифугированием в разрывном градиенте сахарозы Percoll, содержат больше разрушенных мембран и меньше целостных SNS, чем SNS, полученные методом разрывного градиента сахарозы Percoll. Было показано, что SNS, приготовленные с использованием метода разрывного градиента сахарозы Percoll, обладают более высокой активностью синтеза белков de novo, чем SNS, приготовленные методом фильтрации.

Показано, что SNS, приготовленные из молодых мышей, обладают более высокой трансляционной активностью, чем SNS из старых мышей. После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как выделить трансляционно активные синаптические нейрозоны путем гомогенизации коры головного мозга мыши, центрифугирования гомогената в роторе с качающимися стаканами, центрифугирования супернатанта в градиенте сахарозы в роторе с фиксированным углом и последующего сбора полученной полосы синаптических нейрозон.