Мониторинг Равновесие Изменения в структуре РНК "Peroxidative» и «Окислительный" гидроксильных радикалов Footprinting

Общая цель следующего эксперимента заключается в том, чтобы определить, как сворачиваются молекулы РНК, с помощью метода футпринтинга гидроксильными радикалами. Это достигается путем концевого мечения, гель-очистки и предварительного фолдинга РНК, что обеспечивает конформационную целостность РНК перед последующим этапом фолдинга, опосредованного магнием; затем смешивают реагенты Фентона для генерации гидроксильных радикалов, которые впоследствии могут расщеплять остов РНК в зависимости от его доступности для растворителя. Далее продукты расщепления РНК разделяют с помощью денатурирующего полиакриламидного гель-электрофореза и визуализируют методом авторадиографии.

Интегралы полос количественно определяются с помощью программного обеспечения для полуавтоматического анализа футпринтинга. Конечной целью является построение изотерм фолдинга, отражающих формирование третичной структуры РНК. Это достигается путем масштабирования нормированных интегралов полос до значений дробного насыщения.

Впоследствии полученные изотермы можно аппроксимировать по уравнению Хилла. Главное преимущество гидроксильного футпринтинга заключается в том, что информация о третичной структуре РНК получается с использованием недорогих химических реагентов; благодаря высокой активности и малому размеру гидроксильные радикалы являются идеальными зондами для различения доступных растворителю и скрытых нуклеотидов. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов в области структурной биологии РНК.

Например, каким образом рибосомы используют ионы металлов для достижения своей активной конформации? Метод футпринтинга гидроксильным радикалом может быть использован для понимания фундаментальных принципов специфичности и распознавания РНК. Помимо получения информации о третичной структуре РНК, данный метод позволяет определить точные сайты связывания белков в молекулах РНК или ДНК.

Основными трудностями данного метода являются предотвращение деградации образца рибонуклеазой и оптимизация концентрации железа для достижения необходимой степени расщепления РНК. Кроме того, детальный анализ интервалов полос может быть довольно сложным. Главное преимущество этого видео заключается в том, чтобы помочь аудитории разобраться в этапах планирования и успешном проведении эксперимента по футпринтингу с использованием гидроксильных радикалов. Перед началом данного протокола подготовьте все реагенты для футпринтинга, как описано в письменном протоколе.

В дополнение к данному видео, РНК может быть синтезирована с четырьмя родственными DFO и мечена по концу, как описано в соответствующих инструкциях. Очистите радиоактивно меченую РНК с помощью денатурирующего гель-электрофореза. Выделите очищенную РНК путем двух последовательных экстракций из геля с использованием 0.3 молярного раствора ацетата натрия.

Затем осадите РНК, смешав 0,5 миллилитра водного раствора с одним миллилитром этанола. Инкубируйте смесь в течение одной минуты на сухом льду. После центрифугирования образца удалите супернатант. Промойте осадок РНК 70% этанолом.

Удалите супернатант после дополнительного центрифугирования и высушите осадок в вакууме. Затем растворите очищенные образцы РНК, меченные P 32. В 330 µL одного объема реакционного буфера внесите пипеткой 30 µL раствора РНК в новую реакционную пробирку.

Осадите РНК этанолом, затем высушите осадок в вакууме; после высушивания этот осадок можно использовать для создания референсного маркера, как описано в письменной процедуре. Оставшийся буферизованный раствор РНК денатурируйте путем нагревания при 95 °C в течение двух минут. Охладите образцы до комнатной температуры в течение 15 минут, после чего кратковременно центрифугируйте их, чтобы вернуть конденсат в раствор. Для начала эксперимента по футпринтингу подготовьте 27 реакционных пробирок с достаточным количеством образцов для заполнения электрофоретического геля на 30 лунок.

После добавления лестниц и контрольного образца с расщепленным продуктом определите конечные концентрации ионов магния таким образом, чтобы они были равномерно распределены по логарифмической шкале в пределах нескольких порядков величины вокруг средней точки титрования; приготовление ионов магния в одномкратном реакционном буфере описано в тексте отдельно. Инкубируйте раствор РНК и растворы ионов магния при 50 °C в течение пяти минут. Затем смешайте 10 µL раствора РНК с 90 µL соответствующего раствора ионов магния.

Для достижения конечного объема 100 µL инкубируйте каждую смесь в течение 30 минут при 50 °C. Затем оставьте растворы для уравновешивания при 25 °C на один час для фолдинга РНК. Тем временем, непосредственно перед началом реакции футпринтинга гидроксильными радикалами, приготовьте контрольную реакционную смесь согласно письменному протоколу.

Подготовьте реакцию пероксидации, нанеся пипеткой по две микролитровые капли ЭДТА железа, аскорбата натрия и перекиси водорода на верхнюю внутреннюю стенку реакционной пробирки с раствором РНК так, чтобы капли не соприкасались. Запустите реакцию футпринтинга путем интенсивного перемешивания. Через 15 секунд остановите реакцию, добавив 300 микroliters чистого холодного этанола.

Переверните пробирки от трех до пяти раз. В завершение осадите, промойте и высушите осадок, как это выполнялось ранее. В качестве альтернативы перекисной реакции можно провести реакцию окислительного гидроксилирования, добавив в образцы 5 µL свежеприготовленной смеси для реакции Фентона. Инкубируйте смесь для окислительной реакции в течение 30 минут при 25 °C.

Затем добавьте 300 µL чистого холодного этанола для остановки реакции и перемешайте, переворачивая пробирки. Снова проведите осаждение. По завершении либо пероксидативной, либо окислительной реакции промойте и высушите осадок.

Растворите высушенные осадки РНК в восьми µL буфера для нанесения на гель №2. Подтвердите ресуспендирование РНК, меченной P 32, с помощью счетчика Гейгера. Приготовьте денатурирующий 8% полиакриламидный гель для секвенирования согласно стандартным протоколам. Используя гребенку на 30 лунок, нанесите образцы, включая два контрольных образца и один образец с расщепленной РНК.

Проведите разделение фрагментов РНК при мощности от 60 до 75 Вт в течение двух с половиной часов. Экспонируйте высушенный гель на фосфорный экран для хранения в течение ночи. Отсканируйте фосфорный экран с помощью системы визуализации для безпленочной авторадиографии.

Затем перенесите файл с изображением геля на компьютер для анализа. Для начала анализа данных откройте программное обеспечение Safa и программное обеспечение с открытым исходным кодом для аппроксимации и количественного определения одиночных полос. Загрузите последовательность РНК в виде файла .TXT, а затем изображение геля в виде файла .gel.

Определите дорожки и отрегулируйте интенсивность полос. Затем выберите опорную дорожку и выполните выравнивание геля, при котором назначение полос нуклеотидам происходит относительно лестницы digested RNA T1. Количественно определите интенсивность полос и используйте функцию нормализации/цветного графика для нормализации и назначения потенциально инвариантных остатков.

Сохраните результат в виде txt-файла. Программа SFA выдает электронную таблицу, в которой столбцы представляют собой дорожки геля, а строки — интегралы отдельных полос, соответствующих фрагменту РНК. Сначала необходимо определить сайты защиты, демонстрирующие заметное изменение доступности растворителю, путем сравнения профиля защиты, полученного для образца без ионов магния, с профилем для конечной концентрации ионов магния.

Чем ниже значение, тем более защищен нуклеотид от атаки гидроксильных радикалов, и наоборот. Далее, используя электронную таблицу, постройте кривые перехода интенсивности полос отдельных нуклеотидов или групп нуклеотидов в зависимости от концентрации ионов магния; приведите эти переходы к функции дробного насыщения, как описано в текстовой части данного протокола. В качестве заключительного этапа аппроксимируйте данные по уравнению Хилла.

Данный анализ масштабирует переход к дробному насыщению, определяет среднюю точку перехода и обеспечивает феноменологическую проверку того, является ли наблюдаемый переход сигмоидным. Ниже представлены репрезентативные результаты экспериментов по определению «отпечатков» гидроксильных радикалов в P4-P6 rRNA. Изотермы были получены на основе анализа секвенирующих гелей с помощью программы Safa, а затем аппроксимированы согласно описанию в разделе анализа.

Изображение геля показывает, что фоновое расщепление минимально и что возможно определение отдельных нуклеотидов благодаря четко выраженным полосам в дорожке T one. Фрагментация РНК, индуцированная гидроксильным радикалом, значительно превышает фоновый уровень. Переход от низкой к высокой концентрации ионов магния селективно связан со снижением интенсивности отдельных полос и групп полос, что указывает на формирование РНК.

Защита третичной структуры относится к отдельным нуклеотидам или группам смежных нуклеотидов, расщепление которых приводит к сопутствующему изменению интенсивности полос, количественно определяемой и нормализованной с помощью анализа Saffer. Результатом является тепловая карта, визуализирующая степень защиты от гидроксильных радикалов. Переход цвета описывает изменение доступности при добавлении железа и магния: переход от белого к красному указывает на более доступные нуклеотиды, тогда как переход от белого к синему — на более защищенные нуклеотиды.

Каждой степени затенения соответствует числовое значение, которое можно представить в виде кривой защиты и проанализировать с помощью модели связывания, например, уравнения Хилла. В данном примере константа равновесной диссоциации, соответствующая защите от 1 5 3 до 1 5 5, примерно в два раза превышает соответствующее значение для защиты от 1 6 3 до 1 6 4. Этот эксперимент по определению «отпечатков» гидроксильного радикала может быть выполнен за полтора дня при условии правильного проведения.

При выполнении данной процедуры важно не забывать использовать перчатки и лабораторный халат, чтобы избежать любого загрязнения РНК. Кроме того, конечная концентрация железа зависит от экспериментальной системы. Поэтому перед проведением футпринтинга по данной методике мы рекомендуем выполнить эксперимент по определению зависимости «доза-эффект».

Для ответов на дополнительные вопросы могут быть использованы другие методы, такие как определение «отпечатков» гидроксильного радикала с временным разрешением. Например, в какой критический момент времени молекулы РНК принимают неправильную или активную конформацию после своего синтеза? Этот метод открыл исследователям в области структурной биологии путь к изучению как основных, так и промежуточных третичных взаимодействий нуклеиновых кислот.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как определять формирование третичной структуры молекул РНК. Не забывайте, что при работе с реагентами и фосфором второй стадии требуются меры предосторожности в связи с их опасностью; при выполнении данной процедуры рекомендуется использовать перчатки, защитные очки, а также плексигласовый экран.