RNAi скрининга для выявления Постэмбриональное фенотипы в С. Элеганс

Целью данной процедуры является выявление постэмбриональных регуляторов экспрессии и локализации белков у C elegance с помощью геномного скрининга на основе РНК-интерференции и белков с флуоресцентными метками. После создания подходящего скринингового штамма выбирается библиотека РНК-интерференции. Первым этапом процедуры является упаковка клонов библиотеки в бактерии.

Затем бактерии отбирают, культивируют и скармливают нематодам C. elegans соответствующей стадии развития. После 72 часов роста нематод обследуют на предмет изменений интересующего фенотипа. В конечном итоге изменения в экспрессии или субклеточной локализации исследуемого белка визуализируют с помощью флуоресцентной микроскопии.

Данный метод позволяет идентифицировать гены, необходимые для правильной субклеточной локализации белка с флуоресцентной меткой. Тем не менее, этот протокол может быть модифицирован для выявления генов, влияющих на другие интересующие постэмбриональные фенотипы. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими опубликованными протоколами является то, что мы оптимизировали стабильность и уровень РНК-интерференции у животных путем индукции продукции двухцепочечной РНК в бактериях перед посевом.

Процедуру продемонстрирует Кэти Фасс, научный сотрудник моей лаборатории. В течение двух месяцев после начала эксперимента подготовьте библиотеку клонов: сначала проведите посев бактерий из выбранных клонов кормовой библиотеки, а также положительного и отрицательного контролей на чашки с LB-агаром, содержащим тетрациклин. В качестве положительного контроля используйте клон, содержащий ген, который вызывает дозозависимый постэмбриональный фенотип, например BLE four. В качестве отрицательного контроля используйте пустой вектор или клон, содержащий предполагаемый псевдоген без наблюдаемых фенотипов.

Инкубируйте чашки в течение ночи; для каждого клона инокулируйте 2 мл среды LB, содержащей 50 мкг/мл карбоновой кислоты, одной колонией с чашек с разведениями. Инкубируйте культуры в течение ночи при перемешивании. На следующее утро растворы должны стать мутными. Индуцируйте экспрессию двухцепочечной РНК, добавив в культуры IPTG, и инкубируйте их еще четыре-пять часов при тех же условиях.

Добавление IPTG обеспечивает более стабильный и выраженный РНК-индуцированный нокдаун продукта гена по сравнению с использованием только IPTG и метода внесения в агар пластин NGM. После инкубации с IPTG нанесите по 30 µL культуры каждого клона в лунки подготовленных 24-луночных NGM-пластин для РНК-интерференции. Один клон на лунку. На каждой пластине две лунки должны быть отведены под контроли.

Тщательно отметьте расположение каждой библиотеки. Проведите клонирование в 24-луночные планшеты, затем поместите планшеты без крышек в стерильный ламинарный шкаф для высыхания примерно на 20 минут. Не допускайте отслаивания краев агара от стенок планшета.

После переноса стадийно-размеченных нематод на чашки следуйте инструкциям по подготовке нематод. В следующем разделе: начните с популяции нематод первой личиночной стадии или L1. Использование личинок стадии L1 позволяет избежать возможных эмбриональных летальных фенотипов.

Использование популяций животных с согласованным возрастом при скрининге также повышает уверенность в том, что любые наблюдаемые изменения вызваны РНК-интерференцией (RNAi), а не являются обычными вариациями, характерными для разных стадий развития. Однако, если RNAi вызывает задержку развития, это должно быть отмечено исследователем. Отбеливание. Популяция screening-штамма со смешанными стадиями развития.

На данном этапе выживут только эмбрионы, защищенные яичной скорлупой; стадия развития животных будет достигнута в течение 12 часов при температуре 20 °C или в течение 18 часов при температуре 16 °C в день инокуляции бактериальных культур. Выберите три 100-миллиметровые чашки со screening strain, содержащие здоровых животных: как беременных взрослых особей, так и эмбрионы.

Промойте всех животных в стерильной среде M nine и перенесите промывочный раствор в стерильную пробирку объемом 15 мл с завинчивающейся крышкой. Если объем промывочного раствора превышает 3.5 мл, центрифугируйте суспензию с животными и удалите излишки жидкости, оставив 3.5 мл. Если объем составляет менее 3.5 мл.

Доведите объем до 3.5 milliliters водой или раствором M nine, чтобы отделить эмбрионы от взрослых особей; при этом на каждую промывку добавляйте 1.5 milliliters смеси гидроксида натрия и отбеливателя. Инкубируйте животных в данном растворе не более 10 минут. После запуска таймера перемешайте содержимое каждой пробирки на вортексе в течение 10 секунд и повторяйте вортексирование каждые две минуты.

После каждого перемешивания на вортексе осматривайте раствор под стереомикроскопом на наличие останков животных. Через шесть-восемь минут взрослые особи разрушатся, и эмбрионы должны высвободиться. Отделите эмбрионы от раствора гипохлорита натрия путем центрифугирования для получения осадка, после чего максимально удалите супернатант, не затрагивая осадок.

Затем ресуспендируйте осадок в объеме 10 миллилитров, добавив стерильный M nine и используя перемешивание. Повторите этот процесс промывки еще как минимум один раз, пока запах отбеливателя не исчезнет полностью. Чтобы более точно синхронизировать стадии развития животных, остановите их на стадии L1, выведя эмбрионы в среде M nine без добавления пищи.

Для этого эмбрионы в среде M nine переносят в небольшую колбу Эрленмейера. Колбу встряхивают в течение ночи при температуре, соответствующей данной линии и условиям эксперимента. За это время все особи вылупятся и на следующий день остановятся в состоянии диапаузы стадии L1.

Возобновите рост личинок с определенного момента времени, перенеся их на подготовленные бактерии, экспрессирующие двухцепочечную РНК. Это происходит в тот же день, когда на 24-луночные планшеты были нанесены пятна бактерий. Начните с переноса животных стадии L1 в пробирку объемом 15 мл и их центрифугирования. Затем сконцентрируйте животных в 0,5–1 мл среды M9 и нанесите 5 мкл сконцентрированных нематод на чашку.

Подсчитайте количество животных на чашке и доведите концентрацию раствора нематод до 30 особей на каждые от 3 до 10 µL. В завершение нанесите примерно 30 особей животных одной стадии на бактерии в каждую лунку подготовленного планшета.

Использование 24-луночного планшета при содержании более 30 животных на лунку может привести к голоданию. После высыхания пятен, что займет несколько минут, закрепите крышку резиночным кольцом. Инкубируйте животных в перевернутом состоянии при необходимой температуре и в течение требуемого времени, чтобы достичь нужной стадии развития. Когда нематоды будут готовы к скринингу, убедитесь, что положительный и отрицательный контроли демонстрируют ожидаемые фенотипы. Затем осмотрите экспериментальных животных на наличие нарушений развития.

Затем, используя диссекционный микроскоп, закрепите от 8 до 12 животных из каждой лунки на предметных стеклах Agri PET 4% с помощью капли анестетика объемом 5 µL. После наложения соответствующего покровного стекла проведите наблюдения как минимум за пятью животными с помощью светового микроскопа. Ведите систематизированную базу данных, содержащую информацию о гене, количестве наблюдаемых животных и фенотипических результатах.

Для каждого эксперимента по РНК-интерференции (RNAi) подтвердите любой полученный фенотип RNAi с помощью другого вторичного фенотипа, если это возможно, а также путем повторения эксперимента; для повторных опытов можно использовать бактерии из того же штриха. Старые штрихи могут привести к плохому росту в жидких ночных культурах, поэтому их следует сначала пересеять. Некоторые бактериальные культуры растут плохо из-за продукта гена, экспрессируемого в их плазмиде.

В этом случае просто сконцентрируйте бактерии перед посевом на чашки. Для проведения непрерывного скрининга важно всегда иметь в наличии достаточное количество эмбрионов, готовых к определению стадии развития. Скрининговый штамм должен всегда получать питание (не голодать) и быть очищен от контаминантов, которые могут повлиять на изучаемый фенотип.

Мы установили график кормления животных. Гены, влияющие на локализацию DBL one, были идентифицированы с помощью РНК-интерференции (РНКи) с использованием специально разработанного для этого скрининга штамма. Нормальная экспрессия GFP-метки dbl one наблюдается в телах клеток брюшного нервного ствола, а у животных, получавших антисмысловую РНК к DBL, виден ряд пунктирных структур.

Одна мРНК продемонстрировала сильно ослабленную экспрессию DBL one. Эти животные также были маленькими, как и животные с отсутствием функционального DBL L one. Скрининг РНКi позволил успешно идентифицировать множество других генов, продукты которых влияют на локализацию DBL one, что расширило наше понимание механизмов субклеточного транспорта TGF beta и послужило отправной точкой для множества дальнейших исследований.

Используя данный метод, один человек может вполне успешно проводить подготовку и наблюдение за двумя-четырьмя сериями экспериментов каждую неделю. Например, животных, подготовку которых провели в понедельник и вторник, можно наблюдать соответственно в четверг и пятницу, а затем снова провести подготовку животных в пятницу и субботу для наблюдения в понедельник и вторник. Наблюдение следует проводить на протяжении всего процесса скрининга согласно данной процедуре.

Важно иметь достаточный запас эмбрионов для определения стадии развития, поэтому регулярно поддерживайте скрининговую линию. Кроме того, необходимо вести подробные записи всех наблюдений.