Chromosomics: Определение численного и структурные изменения во всех 24 хромосом человека одновременно, используя Роман OctoChrome Анализ FISH
6 февраля 2012 г.
Роман флуоресценции На месте Гибридизации (FISH), который одновременно рассматривается как численные и структурные изменения хромосом, в частности, специфической хромосомной транслокации связанных с лейкемией и лимфомой, из всех 24 хромосом человека на одном устройстве в одной гибридизации, описан.
Метод Octa Chrome Fish позволяет одновременно исследовать все 24 человеческие хромосомы в ходе одной гибридизации на одном предметном стекле. Сначала подготовьте метафазные пластинки на специальном стекле с восемью квадратными зонами. Затем проведите автоматическое сканирование предметного стекла с образцом, чтобы облегчить поиск всех метафаз и обеспечить возможность последующего пересмотра изображений всех клеток.
Затем поместите предметное стекло с восемью лунками на устройство Octa chrome и проведите гибридизацию зондов. Полученные результаты могут продемонстрировать три различные окрашенные целые хромосомы в каждой лунке, в зависимости от расположения комбинаций хромосом на устройстве RO. Идея этого метода RO FISH впервые пришла мне в голову, когда в начале 1990-х годов я начал применять метод FISH в популяционных исследованиях человека.
Затем на ежегодной конференции A A CR в 1994 году я представил свою идею трехцветного окрашивания с использованием восьми квадратных предметных стекол для размещения клеток. Основным преимуществом этого метода по сравнению с существующими подходами, такими как классическое изгибание хромосом и современное спектральное прототипирование, является возможность легко проанализировать все 24 хромосомы человека в большем количестве клеток. Начните с подготовки метафазных клеток, фиксированных в суспензии: в качестве контроля нанесите каплю клеток из пипетки на предметное стекло и проверьте соответствие плотности клеток требуемой.
Теперь погрузите объектное стекло с хромовым покрытием в восемь квадратов, затем поместите его в чистый этанол на две минуты. Чтобы мазки клеток не пересекались, нанесите по 5 µL клеточной суспензии на предметное стекло, распределяя их по квадратам в шахматном порядке. Перед нанесением суспензии на соседние пары участков высушите образцы на воздухе.
Нанесите 20 µL красителя DAPI в концентрации 0,2 µg/mL в центр каждой половины предметного стекла и накройте покровным стеклом. Затем проведите автоматическое сканирование препарата для локализации клеток в метафазе. Используйте программное обеспечение Metaverse для облегчения поиска всех метафаз и последующего повторного анализа всех изображений клеток.
Проведите ручной просмотр результатов сканирования и удалите артефакты, не являющиеся метафазными пластинками. Сначала удалите краситель DPI в двух порциях буфера XSSC, затем обезводьте образцы путем последовательных промывок этанолом. Высушите стекло на воздухе, после чего поместите его на нагревательную плитку при температуре 37 °C на пять минут.
Теперь доведите хрома-зонд, многозонную гибридизационную камеру и гибридизационный буфер до равновесия в водяной бане при 37 °C, расположив их этикетками вниз. Поместите устройство OC chrome на нагревательную плитку с температурой 37 °C. Добавьте по 2 µL предварительно нагретого гибридизационного раствора в каждую из восьми зон.
Осторожно переверните и сориентируйте шаблон. Наденьте его на устройство OC chrome. Убедитесь, что предметное стекло с шаблоном выровнено относительно устройства Octa Chrome.
Затем осторожно опустите предметное стекло на капли гибридизационного раствора и слегка и равномерно надавите, чтобы распределить гибридизационный раствор до краев каждой из приподнятых областей на хромированном устройстве OC. Приподнимите предметное стекло за матовым концом и переверните его так, чтобы стекло оказалось под хромированным устройством OC. Поместите на нагревательную плитку при температуре 37 °C на 10 минут.
Затем перенесите образец на нагревательную плитку при 75 °C на пять минут. Для денатурации образцов перед этапом гибридизации поместите их в многоканальную камеру для гибридизации Chroma Probe. Закройте крышку и оставьте камеру в водяной бане при 37 °C на ночь.
Осторожно извлеките предметное стекло из устройства и промойте в избытке 0,4 SC при 72 °C в течение двух минут. Выполните вторую промывку при комнатной температуре в течение 30 секунд. Добавьте по 20 µL DPI в центр каждой половины предметного стекла и накройте покровным стеклом.
Инкубируйте образцы в темноте в течение 10 минут при комнатной температуре перед анализом с помощью флуоресцентной микроскопии. Анализ Octa chrome для рыб позволяет одновременно исследовать все 24 человеческие хромосомы, используя одну гибридизацию на одном предметном стекле. В каждом квадрате находятся три различных зонда для полнохромосомного окрашивания, которые напрямую помечены флуорофорами разных цветов.
При исследовании нормальной клетки в метафазе в квадрате два системы Octa CHRO видно, что хромосомы 8, 21 и 12 окрашены в красный, зеленый и синий цвета соответственно. Их можно визуализировать по отдельности с помощью соответствующих фильтров или одновременно с использованием тройного фильтра DAPI Fitzy, Texas Red. Данный подход к анализу хромосом применим для выявления аномальных клеток со специфическими для лейкоза хромосомными транслокациями и анеуплоидией.
Например, t(8;21) является распространенной хромосомной транслокацией при остром миелоидном лейкозе. Трисомия 21 (3 копии 21-й хромосомы) представляет собой распространенную анеуплоидию при развитии лейкоза. Данный метод открыл ученым в области молекулярной цитогенетики и молекулярной эпидемиологии возможность исследовать наиболее частые хромосомные перестройки, выявляемые при лейкозах и лимфомах, а также изучать селективную плоидность всех хромосом человека у пациентов или в популяциях, подвергшихся воздействию токсичных химических веществ.
После просмотра этого видео вы должны будете четко понимать, как с помощью анализа Octo Chrome Fish одновременно исследовать все 24 человеческие хромосомы в ходе одной гибридизации на одном предметном стекле. Мы определяем это как хромосомы.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается новый метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), известный как анализ Octa Chrome Fish. Он позволяет одновременно исследовать все 24 хромосомы человека в ходе одной гибридизации на одном предметном стекле, уделяя особое внимание хромосомным перестройкам, связанным с лейкозом и лимфомой.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)
- Хромосомный анализ
- Онкология
Теоретическая часть
- FISH — это метод, используемый для обнаружения и локализации наличия или отсутствия специфических последовательностей ДНК в хромосомах.
- Хромосомные транслокации имеют большое значение при изучении лейкозов и лимфом.
- Данный метод позволяет проводить комплексный анализ хромосомных перестроек.
- Предыдущие методы требовали проведения множественных гибридизаций, что делает данный подход более эффективным.
Цель исследования
- Разработать метод, упрощающий выявление хромосомных аномалий.
- Повысить эффективность хромосомного анализа в клинических условиях.
- Создать инструмент для более глубокого понимания генетических основ гематологических злокачественных новообразований.
Используемые методы
- Подготовка метафазных пластинок на специализированном предметном стекле с восемью квадратами.
- Автоматическое сканирование стекла для поиска метафаз для последующего анализа.
- Гибридизация зондов с использованием устройства Octa Chrome.
- Визуализация результатов, демонстрирующая окрашивание различных целых хромосом в зависимости от их расположения.
Основные результаты
- Метод позволяет успешно визуализировать все 24 хромосомы за одну гибридизацию.
- Результаты могут отображать три разные окрашенные хромосомы в каждом квадрате предметного стекла.
- Облегчает повторный анализ изображений клеток для проведения комплексного исследования.
- Демонстрирует потенциал для применения в исследованиях популяций людей.
Выводы
- Метод Octa Chrome Fish представляет собой значительный прогресс в методологии FISH.
- Данный метод позволяет улучшить выявление хромосомных аберраций при гематологических онкозаболеваниях.
- Он предлагает более эффективный подход для исследователей и клиницистов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Метод OctoChrome-FISH позволяет одновременно выявлять численные и структурные хромосомные перестройки во всех 24 хромосомах человека за одну гибридизацию, что устраняет основное узкое место в цитогенетическом анализе гематологических злокачественных новообразований. Благодаря объединению полногеномного скрининга в единый рабочий процесс на одном предметном стекле, данный метод повышает пропускную способность и воспроизводимость исследований лейкозов и лимфом, способствуя ранней валидации мишеней и снижению рисков при изучении механизмов на этапе доклинических исследований. Эта возможность повышает прогностическую достоверность при идентификации онкогенов, вызванных транслокациями, и паттернов анеуплоидии, имеющих значение при бензол-индуцированном лейкемогенезе и воздействии других токсикантов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации специфических для лейкоза транслокаций, таких как t(9;22), t(15;17), t(8;21) и t(14;18), в их естественном хромосомном контексте.
- Операционная ценность: снижает необходимость в проведении множественных последовательных гибридизаций FISH, что позволяет экономить образцы и ускорять подтверждение мишени в фундаментальных биологических исследованиях.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля проектов за счет одновременной оценки структурных перестроек и общегеномной анеуплоидии, что повышает достоверность ассоциаций между мишенью и заболеванием.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных хромосомных систем для последующего скрининга путем установления базовых кариотипов и определения уровней фоновых изменений в подвергшихся воздействию популяциях.
- Операционная ценность: Стандартизация цитогенетических показателей за счет единообразного мечения зондов и архитектуры препаратов на предметных стеклах, что повышает воспроизводимость результатов между различными лабораториями и в рамках кампаний по скринингу.
- Ценность масштабируемости: Возможность проведения высококонтентного анализа метафазных пластинок с помощью автоматического сканирования, что облегчает повторную оценку и лонгитюдное отслеживание хромосомной стабильности в долгосрочных токсикологических исследованиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная значимость: Связывает этап первичных открытий и доклиническую валидацию, обеспечивая возможность прямого сравнения хромосомных перестроек в клеточных моделях, образцах пациентов и популяционных когортах, подвергшихся воздействию лейкемогенов, таких как бензол.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет определить, являются ли наблюдаемые анеуплоидии или транслокации случайными событиями или паттернами, связанными с воздействием, что необходимо для оценки рисков при разработке трансляционных биомаркеров.
- Ценность преемственности: Обеспечивает плавный переход от данных in vitro к значимости in vivo за счет сохранения хромосомного разрешения при анализе различных модельных систем и человеческих биообразцов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ вписывается в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, позволяя проводить хромосомный анализ на ранних стадиях проверки гипотез и поддерживая идентификацию ведущих соединений путем снижения рисков, связанных с механизмами геномной нестабильности.
- Фундаментальная биология: облегчает проверку гипотез о хромосомных механизмах лейкемогенеза, позволяя проводить одновременный скрининг множества известных и новых перестроек по всему геному.
- Скрининг: обеспечивает получение количественных мультиплексных данных (например, частоты транслокаций, показателей анеуплоидии), что позволяет сравнивать эффекты воздействия соединений или факторов в различных условиях.
- Аналитика: генерирует мультиплексные данные флуоресценции, совместимые с автоматизированной визуализацией и программным кариотипированием, что обеспечивает объективное сравнение состояний хромосом.
- Трансляционные исследования: связывают результаты исследований in vitro с клинической значимостью для человека путем обнаружения идентичных хромосомных паттернов в популяционных исследованиях, что способствует согласованию биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как универсальная цитогенетическая платформа, применимая в программах по онкологии, токсикологии и фармакогеномике, где требуется оценка целостности хромосом.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет сокращения количества ложноотрицательных результатов благодаря полному охвату хромосом.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию и воспроизводимость за счет использования стандартных наборов зондов и формата слайдов, что минимизирует межлабораторную вариабельность.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала за счет снижения расхода реагентов и сокращения времени непосредственной работы по сравнению с последовательными методами FISH или SKY.
- Влияние на портфель: Позволяет принимать решения о продвижении кандидатов с учетом рисков, предоставляя ранние доказательства геномной стабильности или нестабильности ведущих кандидатов.
Особенности реализации
- Для точного получения метафазных пластинок и интерпретации сигналов требуются навыки в области флуоресцентной микроскопии и цитогенетической подготовки.
- Метод зависит от наличия устройства OctoChrome и совместимых гибридизационных камер для одновременной доставки нескольких зондов.
- Необходима стандартизация процедур обработки предметных стекол, денатурации и протоколов промывки для обеспечения стабильного проникновения зондов и оптимального соотношения сигнал/шум.
- Адаптация метода для нечеловеческих модельных систем может потребовать повторной валидации специфичности зондов и эффективности хромосомного окрашивания.
- Практические ограничения включают зависимость от качества образцов в метафазе и возможность перекрытия сигналов в сильно перестроенных геномах, что требует тщательного спектрального разделения.
