Инженерные Приверженец бактерии путем создания единого синтетического Curli Operon

Общая цель следующего эксперимента — придать бактериям адгезивные свойства для облегчения их отделения от жидких сред. Это достигается путем первоначального создания синтетического курли (curli) в обход сложной генетической регуляции, что позволяет легко и массово производить липкие полимеры. На втором этапе адгезивные бактерии визуализируют и количественно определяют на полистироле, что позволяет быстро оценить эффективность синтетического устройства.

Затем адгезивные бактерии визуализируют на стекле с помощью конфокальной микроскопии. Для прямого наблюдения за биопленкой и получения информации о ее структуре получают результаты, которые демонстрируют значительное повышение адгезии у штамма, несущего синтетическое устройство, что подтверждается как измерениями процента адгезии, так и микроскопическими наблюдениями. Основным преимуществом подхода синтетической биологии перед существующими методами, такими как традиционное клонирование, является возможность очень быстрого получения конструкта, содержащего только строго необходимые гены с соответствующими сигналами.

Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов в области биоремедиации, например, в решении проблемы удаления бактерий, насыщенных металлами, из радиоактивных отходов. Как правило, специалистам, впервые применяющим этот метод, может быть сложно, так как требуются базовые знания о генетических регуляторных сигналах и работе с базами данных. Наглядная демонстрация будет сосредоточена на количественном определении и визуализации биопленки, поскольку эти два этапа наиболее трудно освоить из-за хрупкости биокаркасов.

Первым шагом при проектировании синтетического каррона является определение генетической организации генов курли и локализация их эндогенных транскрипционных и трансляционных сигналов. Это осуществляется с помощью специализированных баз данных, таких как REON DB или eco gene. Следующий шаг заключается в выборе пяти абсолютно необходимых генов для синтеза курли: CSGB и CSGA кодируют мономеры волокна, а C-S-G-E-C-S-G-F и CSGG кодируют секреторный комплекс курли; выбранные последовательности извлекаются из базы данных в формате faster. Управление данными и предварительный анализ in silico проводятся с помощью программного обеспечения clone manager, поскольку кластер C-S-G-G-F-E в геноме e coli является антисмысловым.

Эту последовательность необходимо преобразовать в обратный комплементарный вариант. Используя инструменты менеджера клонов, выполните операцию Process Molecule → Invert Molecule, затем вставьте последовательность C-S-G-E-F-G после C-S-G-B-A с помощью функции Ligate. Далее добавьте соответствующий промотор PRCN перед последовательностью iCal C-S-G-B-A-E-F-G.

Локус RCN кодирует FLX-насос RCNA, отвечающий за детоксикацию никеля и кобальта, и его родственный металлорегулятор RCNR. В отсутствие кобальта или никеля репрессор RCNR связывается с RCNR-боксом в ДНК и препятствует полной активации транскрипции нижележащих генов. При повышении внутриклеточной концентрации кобальта или никеля связывание кобальта или никеля с белком RCNR препятствует фиксации репрессора на промоторе, и транскрипционная активность P-R-C-N-A возрастает, помещая пять выбранных «кудрявых» (curly) генов под контроль промотора.

Предполагается, что PRCN curly будут вырабатываться в избытке в присутствии кобальта и никеля. Впоследствии оптимизируйте транскрипционные сигналы, добавив идеальный сайт связывания рибосомы или RBS перед первым A TG последовательности ДНК CS gba, а также второй идеальный RBS перед последовательностью C-S-G-E-F-G. Чтобы соответствовать стандартам I GMs, устройство должно быть ограничено стандартным префиксом bio brick, содержащим сайты рестрикции для ECO R one и X-bar one, и суффиксом, содержащим сайты рестрикции для SPE one и PST one, для облегчения дальнейшей сборки.

Сама часть биокирпича не должна содержать сайтов узнавания EcoRI, PstI, SpeI и XbaI. Следовательно, эти сайты были удалены путем внесения бесшумных мутаций; in silico анализ рестрикции устройства выявил один сайт PstI в последовательности CSGA, один сайт PstI в последовательности RCNR и один сайт EcoRI в гене CSGE. Данные сайты были модифицированы с помощью бесшумных мутаций.

После завершения разработки синтетического оперона проведите симуляцию трансляции с помощью программного обеспечения для управления клонами. Используйте программу выравнивания последовательностей blast, чтобы подтвердить полную гомологию между белками curly дикого типа и белками, кодируемыми синтетическим опероном. Для начала данной процедуры в каждую лунку полистирольного 24-луночного планшета внесите по 2 mL минимальной среды M 63 с 0,2% глюкозы. Инокулируйте каждую лунку 10⁶ клеток бактериальной культуры ночного роста. Культивируйте бактерии при 30 °C от 18 до 48 часов без перемешивания. Каждый столбец 24-луночного планшета соответствует определенной модальности.

При необходимости добавляют соответствующее количество кобальта и антибиотика. Первые три ряда используются для количественного определения адгезированных бактерий путем вычисления среднего значения трех повторностей. Последний ряд слева используется для визуализации биопленки с помощью окрашивания кристаллическим фиолетовым через 18–48 часов; затем из каждой лунки первых трех рядов 24-луночного планшета собирают супернатант, содержащий планктонные клетки, и переносят его в пробирку для гемолиза.

Осторожно промойте каждую лунку одним миллилитром среды M 63 и перенесите промывочный раствор в пробирку для гемолиза к исходному супернатанту. Этот пул называют фракцией свободноплавающих клеток S. Дно лунок микропланшета покрыто прикрепившимися клетками. Для извлечения биопленки добавьте в каждую лунку один миллилитр среды M 63.

Аккуратно соберите осадок кончиком дозатора, затем несколько раз перемешайте содержимое путем всасывания и вытеснения жидкости (пипетирования) и перенесите фракцию биопленки в новую пробирку для гемолиза. Перемешайте содержимое пробирки на вортексе в течение 15 секунд. Соберите фракции биопленки в пробирки для гемолиза.

Данный пул представляет собой клетки, прикрепившиеся к поверхности, обозначенные как B. Перенесите 200 µL супернатанта и фракции биопленки из пробирок для гемолиза в планшет на 96 лунок. Оцените количество прикрепившихся к поверхности и планктонных бактерий по оптической плотности при 600 nm. Процент адгезии для каждого образца рассчитывается по формуле B × 100 / (3 × S + B). Для визуализации биопленки только в последнем ряду 24-луночного планшета удалите планктонные клетки из этих лунок.

Добавьте по 1 мл среды M 63 в каждую лунку, чтобы промыть биопленку, образовавшуюся на дне планшета. Оставьте открытый планшет для высыхания на один час при 80 °C; по истечении часа добавьте по 100 µL 20% кристаллического фиолетового красителя во вторую группу лунок, после чего проведите тщательную промывку водой. Для данного протокола требуется флуоресцентный шасси.

Подходящим хозяином для плазмиды, несущей синтетический curly on, является штамм E. coli SCC1, который конститутивно экспрессирует зеленый флуоресцентный белок без заметных отличий от родительского штамма MG 1 16 55. Трансформируйте хозяйский штамм плазмидой pUC 57, несущей синтетический curli, для получения штамма S 23. Трансформируйте хозяйский штамм контрольной плазмидой pUC 18 для получения контрольного штамма.

В течение 24 часов выращивайте ночные предварительные культуры штаммов S 23 и S 24 при 30 °C в среде M 63 с добавлением глюкозы и ампициллина. На следующий день добавьте 20 мл среды M 63 в чашку Петри, а затем инокулируйте 15 мл среды M 63 в чашках Петри, добавив по 100 µL предварительных культур. Добавьте кобальт в соответствующей концентрации и не забудьте про отрицательный контроль без кобальта.

Поместите три прямоугольных стеклянных покровных стекла в каждую чашку Петри. Инкубируйте чашки в течение ночи при температуре 30 °C без встряхивания. В последующие дни бактерии можно визуализировать непосредственно под флуоресцентным микроскопом.

Важно не допустить высыхания образца, поэтому следующие действия необходимо выполнять осторожно, но быстро. Снимите каждое покровное стекло из чашек Петри и аккуратно слейте жидкость. Тщательно очистите нижнюю поверхность с помощью маленького ватного тампона, смоченного 70% ethanol, чтобы удалить все бактериальные остатки перед конфокальным наблюдением.

Поместите покровное стекло на предметное стекло так, чтобы верхняя поверхность, покрытая биопленковкой, была обращена вверх. Затем биопленковку накройте покровным стеклом большего размера, которое фиксируют к предметному стеклу с помощью лака.

Переверните установку так, чтобы биопленка оказалась на нижней поверхности. Поместите установку под конфокальный лазерный микроскоп для проведения данного эксперимента. В рамках CT micro платформы используется конфокальный лазерный микроскоп Zeiss LSM 510 Meta.

Выберите объектив с масляным погружением с увеличением 40x. Используйте следующие настройки: возбуждение GFP при 488 нм и сбор бактериальной флуоресценции в диапазоне от 500 до 600 нм. Для получения изображений используйте объектив с масляным погружением с увеличением 40x.

В режиме лазерного сканирующего конфокального микроскопа выполните сканирование общих трехмерных структур биопленок от твердой поверхности до границы раздела со средой для культивирования. Используйте шаг сканирования 1 µm.

Выполните трехмерные проекции с помощью программного обеспечения MAUS, определите толщину биопленки путем анализа среднего значения C вдоль статистических продольных сечений. Количественная оценка биопленки и объемов биомассы может быть получена из Z-стеков конфокальной микроскопии. Способность к адгезии штаммов E. coli, модифицированных для гиперпродукции curly в ответ на воздействие металлов, может быть оценена простыми методами.

Например, окрашивание кристаллическим фиолетовым в 24-луночных полированных планшетах Irene позволяет быстро визуализировать образование биопленки на дне каждой лунки, что проявляется в разной интенсивности пурпурного цвета. Судя по всему, штамм дикого типа обладает меньшей адгезивностью, чем сконструированный штамм. Количественным методом является измерение процента адгезии к полистиролу штамма дикого типа и сконструированных штаммов при различных концентрациях кобальта.

Результаты, представленные на данном графике, показывают, что процент адгезии модифицированного штамма в отсутствие кобальта в 1,5 раза выше, чем у штамма дикого типа. Кроме того, наблюдалось значительное усиление адгезии при увеличении концентрации кобальта: в средах с концентрацией кобальта 25 micromolar или 50 micromolar процент адгезии модифицированных клеток достигает 30% и 40% соответственно. Способность к адгезии также можно сравнить с помощью микроскопии бактерий с GFP-меткой, выращенных на предметных стеклах; при эпифлуоресцентной микроскопии зеленые бактерии на черном фоне показывают, что модифицированный штамм формирует биопленку, тогда как штамм дикого типа образует только микроколонии, отмеченные стрелками.

Конфокальный микроскопический анализ позволяет получить общее представление о трехмерной структуре биопленки. Реконструкции вида сверху представлены на панелях A, а реконструкции вида сбоку — на панелях B. Результаты подтверждают, что сконструированный штамм обладает более высокой адгезивностью и формирует более плотную и толстую биопленку по сравнению с диким типом. При выполнении данной процедуры важно дважды проверить план эксперимента, например, для изучения биоремедиационного потенциала модифицированных e coli или occus ants в контексте радиоактивных сточных вод.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проектировать синтетический оперон с помощью программного обеспечения для управления клонированием и как быстро количественно определить экспрессию бактериальных штаммов. Не забывайте, что работа с синтетическими генами и генетически модифицированными организмами может быть крайне опасной. Такие работы должны проводиться в соответствии с действующим законодательством; при выполнении данной процедуры должны всегда соблюдаться меры предосторожности, такие как автоклавирование трансформированных бактерий.