Химически заблокирован антител Microarray для мультиплексный высокой пропускной профилирования конкретных гликозилирования белков в сложных образцов

В данном видеоматериале описывается методика получения профилей гликозилирования 20 различных гликопротеинов в образце сыворотки пациента с гепатоцеллюлярной карциномой с использованием микрочипа с химически блокированными антителами. Сначала специфические антитела к гликопротеинам наносятся непосредственно на предметные стекла микрочипа, после чего гликаны антител блокируются для предотвращения связывания лектинов. При нанесении образцов сыворотки пациентов гликопротеины из образца захватываются антителами. Затем добавляются биотинилированные белки, связывающие гликаны, для детектирования гликанов, и добавляется конъюгированный с нейтравином краситель для маркировки биотинилированных лектинов.

Затем предметное стекло микрочипа сканируют для детектирования флуоресценции; анализ полученных данных позволяет определить профили гликозилирования белков образца. Данный метод обладает рядом преимуществ по сравнению с существующими методами, такими как ВЭЖХ. Этот метод позволяет обнаруживать отдельные гликопротеины в их нативном состоянии.

Скрининг изменений гликозилирования нескольких белков одновременно проводить быстрее и проще. Мы обнаружили, что биомаркеры заболеваний, в частности рака и рака печени, которые мы изучали наиболее тщательно, часто гликозилированы. Мы также выяснили, что способность определять специфические гликоформы значительно повышает эффективность биомаркеров с точки зрения их чувствительности и специфичности.

Таким образом, данный метод позволяет получить представление об изменениях гликозилирования множества сывороточных белков при ГЦК. Он также может быть применен в патоморфологических исследованиях и при поиске биомаркеров других видов рака и заболеваний, таких как рак поджелудочной железы, диабет и болезнь Альцгеймера. Процедуру продемонстрирует Чэнь Лу, техник моей лаборатории.

Начните выполнение данного протокола с подготовки антителового микромассива. Сначала в микроцентрифужных пробирках объемом 0,8 мл на льду разведите все антитела, которые будут использоваться для печати микромассива, до концентрации 0,5 мг/мл в объеме не менее 40 мл PBS; в данном случае в качестве положительного контроля будет использовано 26 различных антител. Также подготовьте такой же объем биотинилированного BSA в PBS с концентрацией 0,5 мг/мл. С помощью дозатора внесите по 40 мл каждого антитела в планшет-источник на 384 лунки на льду.

Затем в программном обеспечении для управления микрочипами укажите расположение каждого антитела. Далее установите планшет в систему микрочипов в качестве источника. Затем загрузите 20 предметных стекол с микрочипами тканей в систему в качестве мишеней.

Настройте микроматричный принтер для печати 48 идентичных субмассивов, в которых 27 антител и контрольных белков наносятся в трехкратной повторности по сетке 9x9. Запустите печать предметных стекол с антителами. Соберите предметные стекла с микроматрицами антител и поместите их в кассету для стекол с осушителем.

Поместите кассету в пластиковый пакет и герметично закройте его, чтобы предотвратить денатурацию белков и появление конденсата на стеклах в процессе хранения. Храните герметично упакованные стекла микрочипа при температуре four degrees Celsius до момента использования. Самым сложным и важным этапом данной процедуры является стадия химической блокировки.

Для обеспечения успешного результата крайне важно нанести на микрочип достаточное количество антител. Всегда готовьте свежие растворы иодида натрия и гидрохлорида агрокислоты непосредственно перед началом эксперимента. Также убедитесь, что процедура окисления проводится при 4 °C в защищенном от света месте.

Достаньте предметные стекла с микрочипами из холодильника и выдержите их при комнатной температуре в течение 30 минут. Извлеките стекло из контейнера для хранения. Кратковременно погрузите стекло в промывочную емкость, содержащую PBS с 0,1% tween 20.

Затем погрузите предметное стекло в 15 мМ буфер ацетата натрия с 0,1% tween на 10 минут. Далее приготовьте свежий раствор 150 мМ периодата натрия в 15 мМ буфере ацетата натрия и перелейте его в кювету для промывки стекол. Храните в холодильнике в защищенном от света месте до использования. Извлеките предметное стекло из буфера ацетата натрия и поместите его в кювету со свежим периодатом натрия стороной с антителами вверх.

Накройте кювету алюминиевой фольгой для защиты от света. Затем поместите кювету со стеклом при температуре 4 °C с осторожным перемешиванием на два часа. Извлеките стекло из кюветы и кратко промойте его в натрияцетатном буфере три раза по пять минут.

Инкубируйте предметное стекло в 300 миллилитрах свежеприготовленного 10 миллимолярного блокирующего раствора гидроглутаминовой кислоты в инкубационной камере в течение двух часов при комнатной температуре при осторожном перемешивании. Извлеките стекла из камеры и промойте их раствором PBS с 0,1% tween в течение трех минут. Затем в кювете для промывки стекол инкубируйте микрочип в 300 миллилитрах 1% BSA в PBS с 0,5% tween в течение одного часа при комнатной температуре при осторожном перемешивании.

Промойте предметные стекла в PBS с 0,1% tween трижды по три минуты. Поместите стекло в штатив для предметных стекол и центрифугируйте при 1 200 ×g в течение двух минут для последующего высушивания стекла с микрочипом. Для разделения каждого субаррея на стекло наносится восковая сетка.

После предварительного нагрева воскового импринтера при 70 °C в течение пяти минут поместите заблокированное стекло микрочипа в импринтер стороной с антителами к воску. Плавно потяните за ручку, чтобы равномерно нанести воск на стекло. Данный метод может быть использован как для гликопрофилирования одного образца, так и для измерения одного гликоэпитопа в нескольких образцах.

Здесь мы продемонстрируем анализ гликопрофилирования. Начните с разведения 40 µL сыворотки в 360 µL PBS, содержащего 0,1% tween 0,1%bridge 35 и по 100 µg/mL IgG мыши, крысы, кролика, козы и осла. Данного объема достаточно для нанесения 6 µL раствора разведенной сыворотки на каждый субремассив.

Осторожно нанесите по 6 µL разведенного образца или контроля на каждый субаррей предметного стекла. Инкубируйте стекло в увлажненной кассете с влажными бумажными полотенцами при комнатной температуре в течение одного часа. Промойте стекло раствором PBS с 0,1% Tween три раза по три минуты.

Затем высушите предметное стекло, центрифугируя его при 1200 ×g в течение двух минут. В микроцентрифужной пробирке объемом 0,8 мл на льду приготовьте 20 µL биотинилированных гликан-связывающих белков в концентрации 10 mg/mL в PBS-Tween. Нанесите по 6 µL разведенных биотинилированных лектинов на каждый субаррей предметного стекла и инкубируйте в увлажненном боксе для предметных стекол с влажными бумажными полотенцами при комнатной температуре в течение одного часа.

После трехкратного промывания предметных стекол раствором PBS с 0,1% Tween, как и ранее, высушите стекло, центрифугируя его при 1200 ×g в течение двух минут. В микроцентрифужной пробирке объемом 0,8 мл на льду приготовьте 400 µL раствора DITE 5 49 labeled neut travain в концентрации 10 mg/mL в PBS с 0,1% Tween. С помощью многоканального дозатора нанесите 6 µL DITE 5 49 labeled neut travain на каждый субмассив и инкубируйте предметное стекло в увлажненной кассете при комнатной температуре в течение одного часа после инкубации.

Промойте предметное стекло раствором PBS с 0,1% tween трижды по три минуты. Высушите предметное стекло, центрифугируя его при 1200 ×g в течение двух минут. Отсканируйте предметное стекло с помощью флуоресцентного микроматричного сканера с разрешением 10 мм.

Настройки лазера и ФЭУ должны быть максимально интенсивными, при этом необходимо убедиться в отсутствии насыщения сигнала. Откройте изображение в программе array Pro 3.2. Настройте шаблон массива в соответствии с картой массива, указывающей расположение пятен антител.

Тщательно совместите каждый круг шаблона с соответствующим пятном на изображении, затем выгрузите интенсивность каждого пятна в файл Excel для дальнейшего анализа. Микроматрица антител, содержащая 48 идентичных субарреев с 26 антителами против 20 сывороточных гликопротеинов и биотинилированного BSA, была разработана и изготовлена согласно описанию в данном видео для изучения значимости процедуры блокировки.

Для анализа профилирования гликопротеинов были подготовлены два идентичных микрочиповых стекла. Одно из них не подвергалось химической блокировке, в то время как на другое был нанесен контрольный образец на субмассивы в первом и третьем столбцах, а объединенный образец сыворотки ГЦР был нанесен на субмассивы во втором и четвертом столбцах 22.

Затем на каждую субарешетку, как показано на этих изображениях субарешеток, наносили биотинилированные лектины, специфичные к различным гликанам. Лектины связывались с захватывающими антителами в контрольных колонках, создавая высокий фон, который был неотличим от фона в колонках с нанесенной сывороткой на неблокированных микромассивах. Однако при проведении того же эксперимента на химически блокированном стекле с антителами в контрольных колонках наблюдалось отсутствие или очень низкий уровень связывания с захватывающими антителами, в то время как в колонках с нанесенной сывороткой отмечалось высокое связывание с антигенами.

Эти результаты демонстрируют, что процедура химической блокировки является критически важным этапом при измерении гликанов в гликопротеинах, захваченных антителами. При соблюдении данного протокола можно получить профили гликозилирования 22 гликопротеинов в сыворотке крови при ГЦК. После освоения данной техники ее выполнение занимает восемь часов при условии правильного проведения. Антитела при модификации могут терять сродство к своим антигенам и другие свойства.

Поэтому важно учитывать этот фактор и использовать несколько различных антител из разных источников при выполнении данной процедуры. Для ответа на дополнительные вопросы, например, обусловлено ли изменение гликозилирования изменением уровней экспрессии белков или исключительно модификацией гликозилирования каждого отдельного белка, можно провести дополнительные исследования, такие как определение концентрации каждого белка с использованием того же микрочипа. Не забывайте, что работа с образцами сыворотки, содержащими патогены, может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование защитных перчаток.