Быстрая и эффективная генерация нейронов из стволовых клеток человека плюрипотентных в Multititre Формат плиты

Общая цель данного эксперимента — дифференцировать плюрипотентные стволовые клетки человека (H PSCs) в нейроны с использованием формата многотитр-планшета. Это достигается путем сбора и высева суспензии единичных клеток H PSCs в 96-луночные планшеты с V-образным дном для формирования эмбриональных тел (EBs) в течение ночи.

Затем EBS переносят в U-образные планшеты с ультранизкой адгезией, содержащие среду для дифференцировки, для индукции образования нейроэктодермы. После этого EBS высевают в чашки, покрытые матригелем, для стимулирования роста нейронов. К восьмому дню методом иммунофлуоресценции можно получить результаты, подтверждающие наличие типичных нейрональных маркеров.

Протоколы окрашивания для дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека в нейроны зачастую сложны и трудоемки. Случайным образом мы обнаружили очень простой способ получения нейронов из плюрипотентных стволовых клеток человека.

С технической точки зрения основным преимуществом данного метода перед существующими является его простота в исполнении, высокая скорость и экономическая эффективность. В то же время процедуру продемонстрирует доктор MI Z из лаборатории. Приготовьте среду для формирования EB и среду для дифференцировки в соответствии с письменным протоколом.

Культивируйте h PSC в бесклеточных условиях, например, в среде, кондиционированной mTeSR, на планшетах, покрытых Matrigel, или с использованием химически определимых систем культивирования в условиях активного роста при субконфлюэнтной плотности. С помощью стереомикроскопа и стерильного пластикового наконечника для пипеток механически удалите спонтанно дифференцированные колонии. Промойте оставшиеся недифференцированные колонии PBS и используйте Accutase с добавлением одного x ингибитора ROCK для диссоциации до состояния единичных клеток.

Осадите одиночные клетки центрифугированием при 200 G в течение двух минут и повторно суспендируйте в небольшом объеме среды для формирования EB. Используйте гемоцитометр для определения титра клеток. Добавьте дополнительные клетки в оставшийся объем среды для формирования EB, чтобы достичь титра от 40 000 до 80 000 клеток на миллилитр.

С помощью многоканального дозатора перенесите по 100 µL в каждую лунку 96-луночного планшета с V-образным дном, чтобы получить от 4 000 до 8 000 клеток на лунку. Центрифугируйте планшет в центрифуге для планшетов с поворотными адаптерами при 400 ×g в течение одной минуты, чтобы осадить все клетки на дно лунок. Перенесите клетки в инкубатор и оставьте для формирования EBS на ночь; на следующий день осмотрите их под стереомикроскопом.

Соберите EBS и перенесите в небольшом объеме в бактериальную чашку диаметром 3,5 сантиметра, содержащую два миллилитра дифференцировочной среды. Промойте клетки, осторожно вращая чашку. Добавьте 100 микролитров дифференцировочной среды в каждую лунку планшета с ультранизкой адгезией.

Вид снизу на 96-луночный планшет под стереомикроскопом. Перенесите EBS небольшими порциями из промывочной чашки в лунки U-типа на 96 лунок. Инкубируйте EBS в течение четырех дней, чтобы на четвертый день произошло формирование нейроэктодермы.

Промойте клетки в дифференцировочной среде и перенесите их по одной в лунки многотитрального планшета с матригелевым покрытием, например, в планшет на 12 лунок. Клетки должны быть распределены по лункам равномерно, чтобы обеспечить беспрепятственный рост нейронов. Оставьте EBS для слабого прикрепления к матригелю примерно на 10 минут при комнатной температуре.

Затем осторожно перенесите планшет в инкубатор. В течение следующих четырех дней из высеянных EBS нейроны будут разрастаться радиально. Ранее мы продемонстрировали, что, как и в случае со многими другими, EBS из H PSCs могут быть получены простым перепосевом агрегатов при рутинном разделении H HPCs в чашки с низкой адгезией.

Это обычно приводит к широкому распределению клеток по размеру. Другая проблема заключается в том, что эмбриональные тельца (EB), поддерживаемые в суспензии, склонны к агрегации друг с другом, что ведет к еще большей гетерогенности размеров. Чтобы обойти эту проблему, единичные H PSCs высевали в лунки с низкой адгезией, что привело к отсутствию формирования EB и гибели клеток. Однако сочетание молекулы выживания клеток Y 2 7 6 3 2 с поливиниловым спиртом, который, как было показано, усиливает формирование EB из HSCs, позволило сформировать EB из суспензий единичных HESC в течение ночи.

Для удобства размеры EB в данном формате многотитровых планшетов можно было строго контролировать, высаживая разное количество клеток в каждую лунку. В отличие от традиционных методов, после переноса EB в 96-луночные планшеты со сверхнизкой адгезией формирование нейроэктодермы индуцировали с помощью коктейля из малых молекул, состоящего из ингибиторов F-G-F-E-R-K-T-G, TGF beta SMA two и BP SMA one, что в дальнейшем позволило высеять клетки на Matrigel для получения нейронов. Инициация формирования EB из примерно 8 000 клеток обеспечила наилучшую способность к нейрональной дифференцировке, которая характеризуется выраженным ростом нейритов из высеянных EB.

Снижение количества некротических центров в ЭБ после посева и высокая экспрессия сенсорных и паннейрональных маркеров, таких как B rrn three A и бета-three tubulin. Общая эффективность нейрональной дифференцировки представляется сопоставимой с исходным методом, который к настоящему моменту применим как к HSCs, так и к HI PSCs. В многолуночном методе были успешно протестированы три независимые линии HPSC, включая клетки HES и HIPS, хотя в целом нельзя исключать вариабельность и различия в эффективности дифференцировки в зависимости от клеточной линии.

На данном рисунке показаны диссоциированные отдельные нейроэктодермальные клетки четвертого дня, которые были высеяны как одиночные клетки и успешно дифференцированы с эффективностью примерно 60%. Работа с EBS на многоканальной платформе изначально требует некоторого обучения, но спустя некоторое время вы убедитесь, что это довольно просто.