Локальные и глобальные методы оценки теплового ноцицепции в

Общая цель данного эксперимента заключается в анализе термической ноцицепции у личинок дрозофилы. Для этого личинок дрозофилы собирают, чтобы затем воздействовать на них вредоносными термическими стимулами. В качестве дополнительного второго этапа личинки могут быть подвергнуты УФ-облучению, которое вызывает повреждение тканей и сенсибилизацию термической ноцицепции. Далее на личинок можно воздействовать локально с помощью теплового зонда или глобально с использованием нагревательной пластины, чтобы вызвать ноцицептивные реакции, которые можно измерить количественно.

Тепловой зонд показывает, что у личинок существует порог ноцицептивного ответа на тепло, а также неожиданная зависимость между температурой воздействия и амплитудой вызванного ответа. Тест с нагревательной платформой демонстрирует, что личинки проявляют стереотипную последовательность ноцицептивных поведенческих реакций, которые зависят от температуры окружающей воды и активности ноцицептивных сенсорных нейронов. Описанные здесь методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области термической ноцицепции, например, различается ли реакция животных на вредоносные тепловые стимулы при их локальном или глобальном воздействии.

Как правило, лицам, впервые знакомящимся с методом анализа с использованием теплового зонда, бывает трудно освоить данную процедуру, так как для минимизации вариаций давления, места приложения и угла ввода зонда требуется практика. Визуальная демонстрация анализа на тепловой пластине имеет решающее значение, поскольку поведенческие реакции, вызываемые повышением температуры, лучше всего воспринимаются при непосредственном наблюдении. Чтобы получить достаточное количество личинок потомства определенного интересующего генотипа, выращивайте желаемую линию напрямую или проведите скрещивание в флаконах с кормом для мух, используя от 20 до 30 неспаривавшихся самок и от 15 до 20 самцов. Через пять дней после откладки яиц соберите и очистите личинок ранней третьей стадии, удалив размягченный корм и промыв их под слабой струей воды через сито с размером пор 630 micron; перенесите личинок ранней третьей стадии на небольшую влажную подушку из корма, чтобы предотвратить их голодание и высыхание.

После подготовки камеры для авторизации с помощью пинцета или кисти аккуратно поместите 10 личинок раннего третьего возраста вдоль внутренней поверхности крышки и закройте её. Работая в вытяжном шкафу, поместите камеру для авторизации в соединительную банку, в которой находится стакан объемом 10 мл с ватным тампоном, пропитанным 1,5 мл этилового эфира. Закрутите крышку соединительной банки, чтобы личинки подверглись воздействию паров эфира в течение 2–2,5 минут.

После проведения анестезии извлеките камеру для анестезии из банки Коплана и подождите несколько секунд в вытяжном шкафу, чтобы остатки паров эфира улетучились. С помощью бутылки-распылителя с водой осторожно перенесите личинок из камеры для анестезии в небольшую чашку Петри. Промокните анестезированных личинок досуха, а затем аккуратно закрепите их спинкой вверх на полоске двустороннего скотча, приклеенного к предметному стеклу размером 3 на 1 дюйм.

Поместите предметное стекло на нижнюю поверхность камеры УФ-облучения и подвергните личинок воздействию УФ-излучения в течение шести секунд при интенсивности 20 мДж/см². После облучения погрузите предметное стекло в воду, чтобы осторожно отделить личинок от двустороннего скотча. С помощью пинцета или кисти осторожно перенесите облученные личинки в контейнер размером 15 на 45 мм.

Стеклянный культуральный флакон объемом в одну драхму, содержащий 1 мл корма для мух, для восстановления личинок в течение от 8 до 24 часов при 25 °C или желаемой температуре культивирования перед повторным введением в хозяина. Для проведения тестов на термическую ноцицепцию предварительно установите температуру термического зонда на нужное значение. С помощью кисти или пинцета осторожно перенесите отдельную личинку на плоскую платформу, убедившись, что личинка покрыта тонким слоем воды.

Для минимизации колебаний давления, а также для обеспечения правильного расположения и угла наклона теплового датчика, необходима регулярная практика. Аккуратно прижмите кончик датчика к личинке в сегменте A4, прилагая легкое давление так, чтобы угол между датчиком и поверхностью личинки составлял примерно 45 градусов. Давление должно вызвать небольшое вдавление поверхности личинки, чего обычно достаточно для предотвращения ее перемещения.

Продолжайте стимулировать личинок до проявления реакции отстранения или до достижения 22-го контрольного замера. Личинки, реагирующие на стимул, обычно сначала демонстрируют предварительное поведение в виде поднятия головы и хвоста, за которым следует реакция отстранения — перекат минимум на 360 градусов. Как только начнется поведение отстранения, прекратите контакт с зондом и зафиксируйте латентный период или время, затраченное на отстранение.

Если в течение 20 секунд реакция отстранения не наблюдается, личинка считается не отвечающей. Расположите волоконно-оптические световоды таким образом, чтобы обеспечить достаточное высококонтрастное освещение. Для наблюдения за личинками поместите нагревательный блок в нагревательную пластину плоской поверхностью вверх, а затем установите нагревательную пластину на основание микроскопа.

Включите нагревательную плитку в режим сильного нагрева и подождите примерно 15 минут, пока температура не стабилизируется на уровне 95 °C. Отмерьте 80 µL дистиллированной воды и с помощью микропипетки поместите каплю воды в центр полистирольной чашки Петри размером 60 x 15 мм. С помощью пинцета осторожно поместите чистую личинку средней третьей стадии развития в центр капли воды, стараясь добавить как можно меньше лишней жидкости.

Осторожно поместите чашку Петри на сплошной нагревательный блок на нагревательной плите. Быстро отрегулируйте положение чашки так, чтобы личинка целиком и капля воды находились в поле зрения. Запустите таймер.

В данный момент чашку Петри помещают на твердый нагревательный блок нагревательной плиты и фиксируют время начала каждого поведенческого акта. Пять. При переносе личинки, погруженной в воду, на нагревательную плиту наблюдаются стереотипные локомоторные реакции. Нормальное поведение в отсутствие нагрева характеризуется «зонтичным» перемещением, сопровождаемым поисковыми движениями головы.

Далее может наблюдаться поведение «биения головой», при котором личинка быстро перемещает голову вперед или в сторону. Это движение похоже на их обычное передвижение в воде, но происходит более прерывисто и сопровождается постоянным перекатыванием. Данное поведение регистрируется, когда личинка совершает боковой перекат как минимум на полных 360 градусов.

Это может происходить разное количество раз и иногда сопровождаться неполными переворотами. Для оценки поведения учитывайте только полные перевороты на 360 градусов. Данное поведение наиболее похоже на ту сцену с локальным применением теплового зонда во время проявления поведения типа «хлыст».

Личинка демонстрирует быстрые сократительно-расслабительные движения вдоль переднезадней оси, в результате которых голова на очень короткое время приближается к хвосту. Хлыстообразные движения часто наблюдаются быстро друг за другом или одновременно с перекатами. В завершение у личинки проявляется судорожное поведение, за которым часто следует паралич. Во время судорожного поведения личинка вытягивается вдоль переднезадней оси и демонстрирует высокочастотные колебания всего тела.

Дрожащее поведение без паралича сгибания наблюдается, когда личинки прекращают движение. У некоторых личинок это состояние становится постоянным, тогда как другие затем демонстрируют низкочастотные пульсирующие движения. На данном графике процента респондентов, относящихся к каждой категории, виден порог реакции личинок на термическую ноцицепцию. В тесте с тепловым зондом 100% личинок проявляют быструю реакцию при температуре зонда до 52 °C.

Однако при температуре 54 °C и выше 90% или более личинок не реагируют даже после 20 секунд контакта. Хотя эти личинки продолжают двигаться после 22-го порога, количество переворотов или время, затраченное на поведение избегания, также могут быть измерены и нанесены на график. Удивительно, но, по-видимому, существует обратная зависимость между температурой зонда и выраженностью ответа, поскольку более низкие температуры, по всей видимости, вызывают большее количество переворотов.

При переносе личинки, погруженной в воду, на нагревательную пластину наблюдается пять стереотипных локомоторных реакций. Здесь представлены средние значения латентного периода возникновения этих реакций, а также средние температуры капли воды, измеренные для каждого периода при оптимальных условиях анализа, описанных в данной работе; процент личинок, проявляющих каждую из этих выраженных реакций, варьировал от 77 до 100%, хотя иногда реакции перекатывания и хлестания могут отсутствовать, перекрывать друг друга или происходить в обратном порядке; здесь также указан процент личинок, выживших после начала реакции паралича в анализе с использованием нагревательной пластины. Личинок нагревали до наступления паралича, после чего возвращали в стандартные условия культивирования для восстановления.

Личинки контрольной группы подвергались аналогичным процедурам, за исключением воздействия тепла; количественная оценка формирования PPE у жизнеспособных взрослых особей проводилась с седьмого по тринадцатый день. Здесь MD G four индуцирует экспрессию трансгенов под контролем UAS во всех четырех классах мультидендритных периферических сенсорных нейронов. UAS or one delta C экспрессирует модифицированную версию открывающегося выпрямляющего калиевого канала Drosophila, необходимого для синаптической передачи, а UAS orrc one delta NC экспрессирует еще более модифицированную версию того же канала, которая не препятствует синаптической передаче.

Обратите внимание, что повышенная латентность четырех из пяти наблюдаемых форм поведения проявляется только у личинок, несущих одновременно драйвер MD GALF four и трансген UAS ORC one delta C. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как измерять локальные и глобальные ответы личинок GEs offal на вредные тепловые раздражители. Эти процедуры можно сочетать с другими методами, например, с генетическим анализом, для идентификации генов, необходимых для термической ноцицепции. При проведении анализа с использованием теплового зонда важно помнить о необходимости минимизации вариативности давления, места приложения и угла контакта зонда.