Эксплантов анализа для оценки сотовой поведение черепно Мезенхима

Целью данной процедуры является мониторинг поведения культуры мезенхимальных клеток черепа в определенных условиях культивирования. Первым этапом является забор рогов матки у мыши с точно определенным сроком беременности.

8,5 дней после коитуса. После изоляции эмбрионы извлекают из децидуальной оболочки, а желточный мешок удаляют для генотипирования. Затем части черепа микродиссецируют и переносят на планшеты для культивирования тканей, покрытые внеклеточным матриксом.

Эксплантаты X оставляют для прикрепления и культивируют до 48 часов в присутствии или отсутствие определенных фармакологических агентов. В конечном итоге делают снимки эксплантатов, чтобы продемонстрировать различия в миграции клеток. Этот метод полезен для ответа на ключевые вопросы, такие как: какие сигнальные пути и белки внеклеточного матрикса участвуют в регуляции поведения краниального гребня во время подъема нейрофолдов.

Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, так как этапы микродиссекции трудно освоить, и для их овладения требуются терпение и практика. Для начала, если планируется проведение иммуногистохимического анализа, подготовьте покровные стекла; в противном случае пропустите этот шаг и нанесите ECM непосредственно на планшеты для культивирования тканей. Стерилизуйте круглые стеклянные покровные стекла диаметром 12 millimeter, погрузив их в этанол. Дайте им высохнуть на воздухе. Затем поместите стерилизованное покровное стекло в каждую лунку 12-луночного планшета.

Работая в ламинарном шкафу, нанесите 1 mL внеклеточного матрикса (ECM) для покрытия покровных стекол или дна планшета для культивирования тканей. Инкубируйте планшет при 37 °C в течение трех часов. После инкубации аспирируйте раствор ECM и промойте трижды в PBS. На данном этапе покрытые планшеты можно использовать сразу или обернуть и хранить при 4 °C до двух недель.

Помогает в визуализации полупрозрачного эмбриона. Готовятся защитные пластины Syl guard с устойчивым черным фоном в соответствии с протоколом производителя.

Подготовьте инструменты для диссекции, вставив иголку-зажим в держатель. Когда все будет готово, используйте точильный блок для заточки пинцетов. Извлеките матку у беременной мыши на сроке 8.5 дней после коитуса.

Поместите изолированную матку в чашку со стерильным PBS и промойте ее. Под диссекционным микроскопом с помощью ножниц и пинцета отделите отдельные децидуальные оболочки. Удалите соединительную ткань матки разрывающим движением, стараясь не оказывать давления, чтобы эмбрион не выскочил из децидуальной оболочки.

С помощью пинцета осторожно разделите ткани матки со стороны, противоположной плаценте. Чтобы извлечь эмбрион, заключенный в желточный мешок, зажмите пинцетом эмбрион вместе с желточным мешком, отделите их от плаценты и удалите ткани матки из чашки. Затем, аккуратно разрывая ткани пинцетом, удалите желточный мешок от эмбриона.

С помощью пипетки перенесите желточный мешок в пробирку Эппендорфа для генотипирования; после изоляции определите стадию развития эмбриона путем подсчета сомитов. В идеале эмбрион должен находиться между 6-й и 10-й стадиями. На этом этапе нейральные складки только начинают подниматься, а основной морфогенез краниальной мезенхимы еще не произошел.

После определения стадии развития перенесите эмбрион на черную планшетную подложку с ограничителем для клеток, содержащую DMEM без фенолового красного. Сначала под диссекционным микроскопом с максимально возможным увеличением сфокусируйтесь на голове эмбриона; используя диссекционные иглы в каждой руке, отсеките голову антериально от области rmba. Затем сделайте разрез вдоль срединной линии для би.

Разделите голову на две равные половины, используя диссекционную иглу в каждой руке. Удалите внешние края вдоль контура головы эмбриона и по срединной линии. Удаляйте ткани по мере необходимости, чтобы избежать смешивания искомого экспланта с ненужными тканями.

Эксплантат будет содержать мигрирующий краниальный нервный гребень, парааксиальную мезодерму и поверхностный эктодерм; удалите слабо прикрепленные клетки. Осторожно произведите пипетирование вверх-вниз, используя наконечник дозатора на 200 µL. Затем аккуратно подберите эксплантат с помощью наконечника дозатора.

В центр лунки покрытой чашки для культивирования тканей, содержащей примерно 10 µL DMEM, поместите 20 µL теплого DMEM с добавлением 15% FBS, после чего чашку можно перенести в инкубатор для культивирования тканей. Примерно через один-два часа эксплантат прикрепится, и можно будет добавить еще 250 µL среды. Примерно через 24 часа эксплантат будет прочно прикреплен к покровному стеклу.

На данном этапе в среду можно добавить фармакологические агенты; спустя еще 24 часа клетки мигрируют из них. Обычно делают снимки для фиксации расстояния и количества клеток, мигрировавших из них. К этому моменту начинают проявляться признаки снижения жизнеспособности при более длительной инкубации.

Ниже представлены примеры миграции клеток из эксплантатов черепного мезенхимального зачатка и хорды. Через 48 часов пребывания на различных субстратах как форма, так и размер клеток, мигрирующих из эксплантата, зависят от типа субстрата. Миграция поддерживалась на фибронектине, ламинине, Matrigel, компонентах внеклеточного матрикса (ECM) и гиалуроновой кислоте.

После выполнения данной процедуры можно использовать другие методы, такие как иммунофлуоресценция и прижизненная визуализация, для дальнейшего изучения путей, регулирующих поведение краниального мезенхимального слоя во время подъема нейрофолдов.