Сотовые слежения Использование Photoconvertible белков в процессе развития данио рерио

Общая цель данной процедуры — отслеживание фотопереключенных клеток в живом эмбрионе рыбки-зебра. Это достигается путем предварительного погружения эмбриона, экспрессирующего тканеспецифичный фотоконвертируемый флуоресцентный белок, в низкоплавкий агароз. Затем белок в интересующей области подвергается полной фотоконверсии.

Затем эмбрион осторожно извлекают из агарозы и содержат в яичной воде при температуре 28.5 °C до достижения более поздних стадий развития. Наконец, фотоконвертированный эмбрион снова заключают в низкоплавкую агарозу. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие, что с помощью конфокальной микроскопии на поздних стадиях можно точно обнаружить фотоконвертированные клетки благодаря стабильному присутствию фотоконвертированного белка.

Мы полагаем, что метод, который мы представим сегодня, будет весьма полезен в контексте клеточной и биологии развития. По нашему мнению, применение данной методологии при изучении миграции клеток, динамики тканей и других форм клеточного поведения будет весьма эффективным. Процедуру продемонстрирует Вероника Ломбардо, постдок из моей лаборатории, после скрещивания трансгенных zebrafish, экспрессирующих фотоконвертируемый флуоресцентный белок.

Выберите наиболее яркие гомозиготные эмбрионы и при достижении ими нужной стадии развития выращивайте их при температуре 28,5 °C. С помощью пинцета удалите хорион в стеклянном контейнере с яйцевой водой для анестезии эмбрионов. Используя стеклянную пипетку или обрезанный наконечник пипетки, по одному перенесите их в триказолин.

Перенесите анестезированный эмбрион на крышку чашки для культивирования и поддерживайте его в минимально возможном объеме среды. Поместите эмбрион в agros, пипетируя его в 1% раствор agros с низким температурным порогом плавления с добавлением trica при 30 °C, и поместите его в чашку для культивирования с покровным стеклом на дне. Используйте гладкий пластиковый наконечник, чтобы сориентировать эмбрион после полимеризации agros.

Покройте образец раствором Trica на инвертированном конфокальном микроскопе, оснащенном лазерными источниками с длиной волны 405, 488 и 561 нм и объективом 20x. Используя лазеры 488 и 561 нм, создайте Z-стек всей структуры образца, включая интересующую область. Выберите инструмент временных серий и настройте два цикла без интервала: один для этапа до фотоконверсии и один для этапа после нее.

Выберите инструмент выделения области и определите одну или несколько областей интереса для фотоконверсии. Затем выберите инструмент выжигания (bleaching) и установите параметр начала выжигания после сканирования. В данном случае используется один из двух диодных лазеров с длиной волны 405 нанометров и мощностью 30 милливатт.

Протокол был тщательно оптимизирован для использования минимального количества лазерного излучения, необходимого для полного фотопереключения, что достигается путем варьирования интенсивности лазерного луча, количества итераций сканирования исследуемой области и скорости сканирования. Просканируйте образец с помощью лазеров с длиной волны 488 нм и 561 нм, чтобы визуализировать остаточную зеленую и полученную в результате фотопереключения красную флуоресценцию фотопереключаемого флуоресцентного белка. После фотопереключения слейте раствор и с помощью иглы или гладкого пластикового наконечника осторожно извлеките эмбрион из агарозы.

Содержите эмбрион в яйцевой воде в темноте при температуре 28.5 °C до достижения желаемой стадии развития. Повторно заключите эмбрион в гель, затем снова с помощью лазеров с длиной волны 488 и 561 нм создайте Z-стек образца, включая интересующую область.

Ниже представлен пример анализа фотоконверсии. Эндотелиальные клетки отслеживали в ходе развития данио-рерио с 48 по 72 час после оплодотворения, используя трансгенную репортерную линию, экспрессирующую kick G в ядрах эндотелиальных клеток. Как показано здесь, до фотоконверсии kick G экспрессировался в эндотелиальной ткани и определялся только как зеленая флуоресценция при использовании 488-нанометрового аргонового лазера; контрольное сканирование с использованием 561-нанометрового лазера для регистрации красной флуоресценции не выявило никакого фотоконвертированного kick GR до начала процесса фотоконверсии.

Впоследствии область интереса была полностью фотоконвертирована с помощью диодного лазера с длиной волны 405 нм при интенсивности 10% и 20 итерациях, после чего сосуды головы были снова просканированы с помощью лазеров с длиной волны 488 нм и 561 нм. На данной панели видно, что в области интереса сигнал green kick G полностью сменился на красный, что позволило отслеживать фотоконвертированные эндотелиальные клетки на более поздних стадиях. Эмбрион наблюдали через 24 часа после фотоконверсии, что соответствует примерно 72 часам после оплодотворения, в эндотелиальных тканях, происходящих из фотоконвертированной области интереса.

Наблюдались как неконвертированные, так и фотоконвертированные белки kick G благодаря стабильности красного флуоресцентного фотоконвертированного kick G и синтезу новых зеленых неконвертированных kick G после их экспрессии. Этот метод открыл исследователям в области биологии развития путь к изучению клеточной биологии и ремоделирования тканей у различных видов рыб.