MODS метод диагностики туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью и туберкулеза

Каждый третий человек в мире инфицирован туберкулезом. Диагностика активного туберкулеза позволяет предотвратить новые случаи заражения, поскольку пациенты с активной формой заболевания ежегодно инфицируют от 10 до 15 других людей до тех пор, пока не пройдут лечение или не умрут. MODS — это аббревиатура, которую мы используем, чтобы избежать постоянного повторения словосочетания «микроскопическое исследование, определение чувствительности к препаратам», и причина такого названия станет понятной по мере разъяснения методологии.

В этом коротком видео мы опишем методику MODS для экспресс-диагностики туберкулеза и туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью с минимальными затратами. В видео методика будет представлена пошагово. Мы обсудим вопросы биобезопасности при работе с жидкими культурами, а также разберем важные аспекты контроля качества, необходимые для применения данной методики.

Метод анализа mods был разработан в Университете Каяна в Лиме, Перу, в лаборатории Боба Гилмана. Он основан на наблюдениях, первоначально сделанных loose cavi. LOOSE стремился найти быстрые способы обнаружения mycobacterium tuberculosis в культурах с использованием колориметрических индикаторов.

Однако она отметила, что при микроскопическом исследовании этих культур рост микробактерий обнаруживался за несколько дней до того, как колориметрические индикаторы меняли цвет, и именно на этом наблюдении был основан метод MOD. Тест MOD был разработан в условиях ограниченных ресурсов и предназначен для использования в подобных условиях, поэтому стоимость одного анализа для обнаружения ТБ в жидкой культуре и выявления множественной лекарственной устойчивости составляет чуть менее 3 долларов. Это чрезвычайно перспективный метод, который впервые обеспечивает подобные диагностические возможности в регионах с ограниченными ресурсами.

Таким образом, анализ MODS основан на трех основных принципах. Первый заключается в том, что mycobacterium tuberculosis растет в жидких средах гораздо быстрее, чем в твердых. Этот факт известен уже много лет.

Во-вторых, если рассматривать данные жидкие среды под микроскопом, мы можем обнаружить рост M. tuberculosis гораздо быстрее, чем при ожидании макроскопического появления колоний на твердых средах. Более того, такой рост настолько характерен, что мы можем отличить M. tuberculosis в жидкой среде от бактериального или грибкового загрязнения, а также от роста возможных атипичных нетуберкулезных микобактерий. Наконец, и это, пожалуй, самое значимое в методе MGIT, заключается в том, что мы можем добавить препараты, такие как рифампицин, и таким образом напрямую определить множественную лекарственную устойчивость в мокроте.

Используя эти препараты в начале анализа, мы можем одновременно выявить туберкулез и определить, устойчив ли изолят к этим двум препаратам. Это избавляет от необходимости проведения субкультивирования и создания косвенного теста на лекарственную чувствительность. Теперь мы кратко опишем оборудование, необходимое для проведения анализа MODS.

Для хранения приготовленных сред потребуется холодильник. Для взвешивания реагентов и рифампина необходимы весы. Для перемешивания мокроты потребуется вортекс.

Для работы с деконтаминирующим раствором требуется центрифуга для концентрирования деконтаминированного образца мокроты, способная развивать ускорение 3000 G. Центрифуга не обязательно должна быть с охлаждением, однако крайне важно, чтобы она была биологически безопасной. Для работы с микобактериями необходимо, чтобы стаканы центрифуги были оснащены герметичными завинчивающимися крышками. Также требуется инкубатор, способный достигать и поддерживать температуру 37 °C.

Использование среды, обогащенной CO2, не обязательно. Для считывания результатов на чашках с модификациями требуется инвертированный микроскоп с объективами 4x и 10x; автоклав необходим для стерилизации сред, а также для утилизации микробных культур. Для внесения аликвот в среды требуются микродозаторы, а также шкаф биологической безопасности II класса для процедур, связанных с манипуляциями с образцами мокроты и инокуляцией чашек.

Для проведения анализа MODS требуются следующие реагенты: среда Middlebrook 7H9, казеин и глицерин, антибиотическая добавка Panta и питательная добавка OADC. Стоки антибиотиков включают в себя рифампицин; диметилсульфоксид (DMSO) для приготовления рифампицина; гидроксид натрия, цитрат натрия и N-ацетил-L-цистеин для деконтаминации мокроты; дигидрофосфат натрия и монофосфат калия для приготовления фосфатного буфера; 10% гипохлорит натрия для утилизации инфицированных отходов и дезинфицирующее средство для очистки рабочих поверхностей. Также требуются следующие пластиковые изделия и расходные материалы: стерильные стеклянные пробирки, фильтры с порами 0,2 µm для водных растворителей и фильтры с порами 0,2 µm для органических растворителей, микроцентрифужные пробирки, центрифужные пробирки объемом 15 мл, стерильные серологические пипетки объемом 50 мл и 10 мл, стерильные наконечники для микропипеток, 24-луночные планшеты для культивирования тканей и герметичные пакеты типа Ziploc, в которые помещаются 24-луночные планшеты после инокуляции образца мокроты в среду.

Можно заранее приготовить четыре группы основных растворов. Фосфатный буферный раствор состоит из смеси растворов дигидрофосфата натрия и монофосфата калия с pH 6,8 ± 0,2. Этот раствор автоклавируют при температуре 121–124 °C в течение 15 минут для стерилизации, после чего аликвоту высевают на питательный агар для подтверждения стерильности.

Данный раствор можно хранить в холодильнике при температуре от 2 до 8 °C в течение одного месяца. Для каждого образца мокроты требуется 10 мл фосфатного буферного раствора. В качестве основного раствора для деконтаминации мокроты используется комбинация гидроксида натрия и цитрата натрия.

Эти растворы смешивают в равных объемах и автоклавируют при 121–124 °C в течение 15 минут; также их можно хранить в холодильнике при температуре от 2 до 8 °C до одного месяца. Для каждой пробы мокроты требуется 2 мл этого раствора. Базовая питательная среда состоит из среды Middlebrook 7H9 с добавлением казеина и глицерина.

Порошок среды 7H9 растворяют в стерильной дистиллированной воде, содержащей глицерин и казеин, и перемешивают при постоянном перемешивании до полного растворения. Эту среду автоклавируют при 121–124 °C в течение 15 минут, а после охлаждения разливают по 4,5 мл в стерильные стеклянные пробирки размером 16 × 100 мм. Среду инкубируют при 37 °C в течение 48 часов для проверки стерильности, которая подтверждается отсутствием помутнения по истечении этого времени; среду можно хранить при температуре от 2 до 8 °C с плотно закрытой крышкой до одного месяца.

Для каждого образца мокроты требуется одна пробирка, содержащая 4,5 миллилитра данной культуральной среды. Сток-растворы антибиотиков готовят следующим образом: полностью растворяют вещество в стерильной дистиллированной воде и фильтруют с помощью шприцевого фильтра с размером пор 0,2 мкм для водных растворителей. Затем аликвоты по 20 µL можно хранить в стерильных микроцентрифужных пробирках при температуре -20 °C до шести месяцев; одной аликвоты объемом 20 µL достаточно для анализа до ста образцов.

Стоковые растворы рифампина с концентрацией 8 мг/мл готовят путем растворения рифампицина в DMSO и стерильной дистиллированной воде. Эту смесь фильтруют через шприцевой фильтр для органических растворителей с размером пор 0,2 мкм; полученный раствор можно хранить в стерильных микроцентрифужных пробирках в виде аликвот по 20 мкл при температуре -20 °C до шести месяцев. Каждой аликвоты объемом 20 мкл достаточно для анализа до 100 образцов. Теперь перейдем к самой методике и трем этапам, которые необходимо выполнить в день проведения процедуры.

Здесь описывается процесс перевода стоковых растворов в рабочие растворы. Сначала мы подготавливаем раствор для деконтаминации, затем — питательную среду. И, наконец, рабочие растворы препаратов изониазида и рифампицина.

Метод деконтаминации, используемый в методике mods, представляет собой стандартизированную методику деконтаминации с применением гидроксида натрия и N-ацетилцистеина (NALK). NALK является муколитиком, который способствует разжижению мокроты, что позволяет гидроксиду натрия провести деконтаминацию. Для этого нам потребуется исходный раствор гидроксида натрия и цитрата натрия, к 20 мл которого добавляют 0,1 г NALK.

Любой раствор, не использованный в день приготовления, подлежит утилизации. Окончательное приготовление питательной среды также следует проводить только в день использования. Хранящуюся среду Seven H nine объединяют с OADC и Panta: в каждую пробирку добавляют 4,5 мл среды, 0,5 мл OADC и 0,1 мл Panta.

Этого достаточно для одного образца. Рабочие растворы каждого препарата готовят в день использования; неиспользованные растворы следует утилизировать, так как активность хранимых аликвот не гарантируется. Аликвоты последовательно разводят в 24-луночных планшетах для культивирования тканей с использованием среды 7H9 OADC таким образом, чтобы конечная концентрация в лунке после добавления образца мокроты с средой составила 0,4 мкг/мл для фосмицина и 1 мкг/мл для рифампина.

Перейдем к процедуре деконтаминации: 2 мл образца мокроты помещают в коническую пробирку Falcon, после чего добавляют 2 мл раствора деконтаминанта на основе гидроксида натрия. Крышку закрывают и плотно завинчивают, затем суспензию перемешивают на вортексе и оставляют на 15 минут для проведения процедуры деконтаминации. По истечении этого времени добавляют 14 мл фосфатного буферного раствора.

Крышку закрывают и плотно завинчивают, после чего пробирку помещают в центрифугу; после центрифугирования в течение 50 минут при 3000 G супернатант S сливают, а оставшийся осадок представляет собой образец, который необходимо высеять, используя пробирки объемом 5,1 мл с средой 7H9 OEDC panter. Осадок ресуспендируют до объема приблизительно два миллилитра. Половину этого ресуспендированного образца сохраняют в качестве резерва в микроцентрифужной пробирке.

Это позволит нам иметь резерв на случай контаминации культуры и необходимости повторного высева образца. Остальной миллилитр добавляют к остальным семи миллилитрам H nine oh a DC panter в стеклянной пробирке, и таким образом образец готов к высеву. По 900 µL данной суспензии среды и образца помещают в каждую из четырех лунок одного столбца 24-луночного планшета.

Остальные лунки планшета на 24 лунки заполняются последующими образцами таким образом, чтобы в один планшет входило пять образцов (по одному на каждую из пяти колонок), а шестая колонка оставалась без образца. Шестая колонка служит отрицательным контролем. В эту колонку помещаются все компоненты среды без образца мокроты; любое явное прорастание в этой колонке указывает на проблему перекрестного загрязнения, и весь планшет подлежит утилизации.

Каждая используемая нами планшетка должна содержать колонку с отрицательным контролем. Таким образом, в данной планшетке находятся все наши образцы и среда. Суспензии антибиотиков необходимо добавить в отдельную планшетку.

Мы подготовили разведения рифампина и Isid, как было описано ранее, и с помощью четырехканального многоканального дозатора отобрали по 100 µL из каждой из этих лунок, затем распределили по 100 µL среды 7H9 OADC в каждую из двух контрольных лунок, а также по 100 µL рифампина и 100 µL Isid в каждую из двух лунок с препаратами. После заполнения планшета его закрывают крышкой и помещают в пакет Ziploc; с этого момента пакет больше не открывается, и, следовательно, любые культуры, растущие в жидкой среде, никогда не имеют возможности покинуть пакет.

Все последующие считывания показателей планшета проводятся внутри пакета, который затем помещается в пакет для автоклавирования и утилизируется по завершении культивирования. Таким образом мы избегаем манипуляций с высококонцентрированными суспензиями микобактерий. Теперь мы кратко остановимся на вопросах контроля качества.

Методика mods включает встроенные контроли качества, которые необходимы для правильного проведения анализа. Прежде всего, предусмотрены отрицательные контроли, которые используются на каждой планшете. О них упоминалось ранее, но если вкратце: на планшете рядом с пятью образцами мокроты имеется колонка, содержащая все компоненты среды без образца мокроты. Лунки в этой колонке следует исследовать так же, как и любые другие лунки; наличие любого роста в этих лунках указывает на произошедшую перекрестную контаминацию, вследствие чего ни одному из результатов на данном планшете нельзя доверять.

В таком случае планшет необходимо утилизировать, а все образцы — пересеять. Кроме того, предусмотрены внутренние контроли, которые являются положительными контролями. Их анализируют на отдельном планшете, который подготавливают в конце дня после подготовки всех остальных планшетов с образцами, чтобы минимизировать риск перекрестного загрязнения в лаборатории.

На этой отдельной планшете мы используем один полностью чувствительный штамм mycobacterium tuberculosis и штамм, устойчивый к исидорапикуру и рифампицину. Если существуют опасения по поводу использования штамма с множественной лекарственной устойчивостью на планшете, вместо этих двух чувствительного и MDR-штаммов можно использовать штамм с монорезистентностью к рифампицину и штамм с монорезистентностью к исидорапикуру. Цель использования этих штаммов заключается в том, чтобы продемонстрировать не только то, что среда поддерживает рост (следовательно, все наши положительные контроли должны расти в лунках без препаратов), но и то, что концентрации препаратов верны; таким образом, чувствительные положительные контроли не должны расти в присутствии исидорапикура и рифампицина, а резистентные положительные контроли должны, очевидно, расти при концентрациях рифампицина и исидорапикура, присутствующих в планшете.

Теперь перейдем к считыванию планшетов. Если считать днем нулевым день посева образцов из пробоотборников, то считывание планшетов начинается на пятый день. До этого момента рост микобактерий наблюдается крайне редко.

Планшеты исследуют с помощью инвертированного светового микроскопа. Это означает, что планшеты осматривают снизу вверх, что позволяет четко видеть тяжи; попытки визуализировать культуры сверху затруднены из-за конденсата на крышках планшетов, а также из-за того, что фокусного расстояния стандартного микроскопа недостаточно. Микроскопическое исследование обычно проводят с использованием объектива 10x; положительными считаются культуры, в которых в обоих лунках без лекарственных препаратов имеется не менее двух колониеобразующих единиц.

Присутствие контаминации легко распознать по помутнению среды, а к пятому дню обычно наблюдается избыточный рост микроорганизмов по большей части лунки. Напротив, рост микобактерий не приводит к помутнению лунки; при первоначальном росте микобактерии образуют небольшие формы, напоминающие запятые, которые постепенно развиваются в характерные шнуры или сплетения. В течение двух недель при выраженном положительном росте образуются конгломераты микобактерий, при этом шнуры становятся действительно заметны только на периферии.

Подавляющее большинство культур, которые становятся положительными, дают положительный результат к 14-му дню, поэтому мы рекомендуем проводить ежедневные считывания с пятого по четырнадцатый день, а затем каждые два или три дня в зависимости от нагрузки лаборатории. В день, когда культура в двух лунках без препаратов становится явно положительной, следует считать результаты в лунках с препаратами. Любой рост в присутствии любого из препаратов указывает на резистентность к этому препарату. Очень важно отметить, что если считывание лунок с препаратами проводится более чем через одну неделю после выявления положительной культуры в лунках без препаратов, это может не означать резистентность, так как иногда наблюдается спонтанный прорывной рост.

Снятие показаний можно прекратить на 21-й день, если культура отрицательна, поскольку положительные культуры после этого времени никогда не встречаются у пациентов, не получающих терапии. По завершении 21 дня инкубации культуры можно утилизировать. Культуры остаются в пакетах Ziploc, которые помещаются в автоклавные пакеты и автоклавируются при температуре от 121 до 124 градусов centigrade в течение 45–60 минут, после чего их можно безопасно утилизировать. Теперь я вкратце расскажу о биобезопасности и анализе MODS, так как мы внедряли MODS не только в Перу, но и в странах Африки и Азии.

Часто возникает вопрос о безопасности и биобезопасности использования культур микобактерий в жидких средах. Этот страх понятен, так как жидкости могут пролиться, в то время как твердые среды не несут такого риска, кроме того, при работе с суспензиями микобактерий существует риск аэрозолизации. Именно по этим причинам мы считаем, что методика mod является более безопасной, чем любая методика, требующая проведения косвенного тестирования на лекарственную чувствительность.

Это объясняется тем, что для проведения косвенного теста на чувствительность готовится суспензия микроорганизмов с известной концентрацией. Таким образом, данный процесс предполагает работу с высококонцентрированными растворами микроорганизмов, что сопряжено с рисками пролива и образования аэрозолей. Напротив, методика mods, как вы уже убедились, заключается в простом инокулировании образца мокроты в наш планшет, после чего планшет герметично закрывается в пластиковом пакете.

Этот пакет больше никогда не открывается, и поэтому нам не приходится работать с этими высококонцентрированными суспензиями. Это не означает, что мы считаем методику MOD полностью безопасной — работа с микобактериями всегда сопряжена с риском. Однако данные из Кореи, опубликованные в 2006 году, похоже, подтвердили нашу позицию, согласно которой метод MOD не более опасен, чем посев любой другой культуры.

В ходе данного исследования, проведенного среди сотрудников лабораторий, было показано, что профессиональные риски для работников, которые осуществляли посев культур и не отвечали за тестирование на лекарственную чувствительность, были не выше, чем для тех, кто выполнял микроскопию мазков мокроты. Напротив, у лиц, работающих с суспензиями микобактерий и проводящих тестирование на лекарственную чувствительность, наблюдались значительно более высокие показатели профессионального риска заражения туберкулезом. Очевидно, что крайне важно обеспечить максимально возможную защиту всего персонала лабораторий, и поэтому мы настоятельно рекомендуем не проводить ни одну из этих процедур без соответствующих средств индивидуальной защиты органов дыхания, под которыми мы подразумеваем маски стандарта N95.

Кроме того, требуется шкаф или вытяжной шкаф биологической безопасности второго класса, в котором весь выходящий воздух проходит через HEPA-фильтры. Наконец, простым, но очень важным механизмом для предотвращения турбулентности воздушного потока в лаборатории является замок на двери лаборатории, чтобы исключить вход и выход персонала во время обработки образцов. Это снижает риск передачи инфекции внутри лаборатории. Надеюсь, что это дало вам хорошее представление о том, что включает в себя методология MODS и насколько она может быть полезна в условиях ограниченных ресурсов, когда срочно требуется высококачественная диагностика ТБ и МЛУ-ТБ.

Для получения дополнительной информации вы можете посетить наш веб-сайт mods peru. org, где представлены подробные стандартные операционные процедуры и руководство пользователя системы MODS. Помимо СОП по обработке внелегочных образцов, у нас также имеется фотобиблиотека mycobacterium и tuberculosis, других микобактерий, а также бактериальной и грибковой контаминации; кроме того, вы можете ознакомиться с нашей стратегией обеспечения качества и рекомендуемой процедурой аккредитации лабораторий для начала использования MODS.

Наконец, прилагается список часто задаваемых вопросов; мы будем рады любым отзывам от пользователей, которые в настоящее время используют модификации, так как данная методика является итеративной. Как мы объяснили ранее, этот тест не является проприетарным, и мы всегда заинтересованы в улучшениях, которых удалось добиться другим лабораториям.