Head-On RNA Polimeraz Stalled Çoğaltma Fork Doğrudan yeniden başlatın

Bu prosedürün genel amacı, karşı karşıya bir çarpışmanın ardından Repli bölgesinin ve RNA polimerazın veya RNAP'nin akıbetini gözlemlemektir. Bu, öncelikle biyotinlenmiş DNA üzerinde transkripsiyon kompleksinin kurulması ve Stripp tablet ile boncuklar üzerine immobilize edilmesiyle gerçekleştirilir; bu işlem, durdurulmuş RNAP elongasyon kompleksi ile sonuçlanacaktır. Prosedürün ikinci adımı, karşı karşıya RNAP'nin aşağısında bir replikasyon çatalı oluşturmak için önceden çatallanmış DNA'nın RNAP elongasyon kompleksine ligasyonudur.

Prosedürün üçüncü adımı, repli zonun kurulması ve replikasyon çatalında öncü zincir sentezinin başlatılmasıdır. Prosedürün son adımı, DNA'nın manyetik boncuklardan izole edilmesi ve bir PCR temizleme kolonu üzerinden saflaştırılmasıdır. Nihayetinde, saflaştırılmış radyolabelenmiş DNA ürünlerinin alkali agaroz jeli aracılığıyla, roso'nun kafa kafaya transkripsiyon kompleksi ile çarpışması üzerine duraksadığını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Rockefeller Üniversitesi'ndeki Mike O'Donnell Laboratuvarı'ndan Richard Pomerance. Bugün size katı fazda ribozomun RNA polimeraz ile kafa kafaya çarpışmasının nasıl gerçekleştirileceğine dair prosedürü göstereceğim. Laboratuvarımızda bu prosedürü, replikasyon sürecinin DNA boyunca yer alan transkripsiyon komplekslerinden nasıl etkilendiğini incelemek için kullanıyorum.

Hadi başlayalım. Bu protokole başlamak için, RNAP holo enzimini, T7 A1 promoterini içeren biotinillenmiş 3.6 KB DNA kalıbı ile 100 µL tampon A içinde karıştırın ve karışımı 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. 10 dakikalık inkübasyonun ardından, RNA sentezini 20 nükleotit ile sınırlayacak olan adenozin trifosfat, sitidin trifosfat ve uridin trifosfat ribonükleotidlerini ekleyin.

Durdurulmuş RN ape uzama kompleksini boncuklara immobilize etmek için çözeltiyi 37 °C'de 10 dakika daha inkübe edin. Çözeltiyi streptavidin kaplı manyetik boncuklara ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

İmmobilize edilmiş durdurulmuş RNAP elongasyon kompleksini, boncukları 0,9 milliliters yüksek tuz tamponu ile yıkayarak saflaştırın. Her yıkamanın ardından spesifik olmayan R-N-A-P-D-N-A komplekslerini uzaklaştırmak için süpernatantı manyetik ayırma yöntemiyle alın. Bu yıkama işlemi beş kez tekrarlanmalıdır.

Ardından boncuklar, 0.9 milliliters Tampon A ile iki kez daha yıkanmalıdır. Son yıkamadan sonra, head-On RNAP'nin aşağısında bir replikasyon çatalı oluşturmak için aşağı akış replikasyon çatalı birleştirilebilir. Durdurulmuş RNAP elongasyon kompleksine tutunmuş boncukları görünür kılmak için manyetik şeridi 100 microliters New England Biolabs Tampon 4 içinde süspanse edin. Daha sonra, 10 units karides alkalin fosfataz veya SAP 1 ekleyin ve örneği 37 degrees Celsius'ta 10 dakika inkübe edin. Boncukları 0.9 milliliters Tampon A ile üç kez yıkayın. Ardından boncukları 50 microliters Quick T4 ligasyon reaksiyon tamponu içinde yeniden süspanse edin.

İki mikrolitre quick T4 ligaz ekleyin ve çatallı DNA'yı önceden hazırlayın, çözeltiyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Son olarak, boncukları 0.9 mililitre tampon A karışımı ile üç kez daha yıkayın; hekzamer DNA helikazı, durdurulmuş RNAP elongasyon kompleksine ve aşağı akış yönündeki replikasyon çatalına bağlı olan manyetik strep A boncuklarıyla karıştırın. Çözeltiyi 150 mikrolitre tampon A içinde hazırlayın ve 23 °C'de 30 saniye boyunca inkübe edin.

23 °C'deki kısa süreli 32. inkübasyonun ardından, polimeraz üç beta klempe, toplam hacim 200 µL olacak şekilde A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P, α P 32 ile işaretli DGTP ve α P 32 ile işaretli DATP ekleyin. Örneği 37 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin.

Tek zincirli DNA bağlayıcı protein DCTP ve DTTP ekleyerek replikasyonu başlatın. Ayrıca, final hacmi 250 microliters olacak şekilde alfa P 32 ile işaretlenmiş DTTP ve DCTP ekleyin. 10 dakika sonra, 12 microliters 0.5 molar EDTA ekleyerek reaksiyonları sonlandırın.

Ardından, DNA'yı boncuklardan serbest bırakmak için strp din boncuklarını kaynatın. Boncukları 50 °C'de 30 dakika boyunca proteinaz K ile muamele ederek kalıntı DNA'yı uzaklaştırın. Boncukları tekrar kaynatın ve manyetik ayırma yöntemiyle süpernatantı uzaklaştırın.

DNA içeren birleştirilmiş süpernatantı Kyogen PCR temizleme kiti kullanarak saflaştırın. Son olarak, saflaştırılmış radyoaktif işaretli DNA ürünlerini alkali agaroz jelde analiz edin. Bölgenin RNAP ile kafa kafaya çarpışması genellikle 2.5 KB ve 3.6 KB uzunluğunda iki ürünle sonuçlanır. 2.5 KB'lık ürün, çataldan durdurulan RNAP'ye kadar olan DNA uzunluğunu temsil eder.

Bu durum, RNAP ile çarpışma sonucu replikasyonun durmasından kaynaklanır. 3,6 KB'lık ürün, tam uzunluktaki DNA'yı temsil eder ve ya RNAP'nin promotörü tam olarak doldurmamasından ya da replikasyonun kafa kafaya karşı karşıya gelen RNAP'yi kısmen okuyup geçmesinden kaynaklanır. İyi bir sonuç, yaklaşık %50 oranında tam uzunlukta DNA üretildiğini gösterir.

Ancak bazı durumlarda, promotörün RNAP tarafından doluluk oranı daha düşük olur ve daha yüksek oranda tam uzunlukta DNA gözlemlenir. Bunun nedeni, durdurulmuş bir RNAP'nin yokluğunda, replikasyon bölgelerinin daha büyük bir kısmının kafa kafaya RNAP replikasyonu ile karşılaşmamasının yalnızca tam uzunlukta DNA ile sonuçlanmasıdır. DNA'ya bağlı durdurulmuş bir RNA polimeraz uzama kompleksinin varlığında replikasyonun ve katı fazın nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk. Bu prosedür uygulanırken, DNA'ya spesifik olmayan şekilde bağlanarak replikasyonu inhibe eden fazla RNA polimerazı uzaklaştırmak için durdurulmuş transkripsiyon kompleksinin yüksek tuz ile yıkanması önemlidir.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.