Hücreli Davranış kaydetme Myxococcus xanthus Biyofilmler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tekrarlanabilir ve nicelendirilebilir sonuçlar üretmek için yeterli titizliğe sahip, düşük maliyetli bir zaman ayarlı mikrosinematografi deneyi geliştirmektir. Bu, agar ortam plakaları veya mikroskop lamları oluşturmak için ucuz, yeniden kullanılabilir silikon contaların kullanılmasıyla gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sonuçlar, bu plaka komplekslerinin çeşitli ortam türleri ve agar konsantrasyonlarında bir haftadan fazla süreyle nemli kaldığını ve yeterince oksijenlendiğini göstermektedir.

Ayrıca, zaman ayarlı mikro sinematografi yavaş bir süreç olduğu için, sekiz adet ucuz mikroskobun kullanılması veri toplama sürecini hızlandırmaya yardımcı olur. Merhaba, ben Syracuse Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden Dr. Roy Welch'in laboratuvarından Ryan Taylor. Bugün size laboratuvarımızdaki bakteriyel biyofilmlerin zaman ayarlı videolarını çekme prosedürünü göstereceğiz; bu prosedürü MTI biyofilmlerinin çok hücreli davranışlarını incelemek için kullanacağız.

Hadi başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, bir hücre sayacı kullanarak gece boyunca inkübe edilmiş bir Occus sanus kültürünün hücre yoğunluğunu ölçün; kültürden 1 mL alarak 2,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın, bakterileri beraberindeki yazılı protokolde açıklandığı şekilde TPM besiyerinde pellete getirin, yıkayın ve yeniden süspande edin; pelletin tamamen süspande olması biraz zaman alabileceğinden pipetleme ve vorteksleme yapın. Ardından, analiz besiyeri olan 50 mL TPM'e 0,5 g aros ekleyin.

Ayrıca, sterilizasyon için otoklavda steril edilen besiyeri disk medyumu olan 50 mililitre C-T-T-Y-E'ye 0.5 gram aros ekleyin. Ardından, takip analizini oluştururken medyumu bir inkübatörde veya su banyosunda 55 degrees Celsius sıcaklıkta tutun.

Plaka kompleksleri, önce alev sterilizatörü ile cam mikroskop lamını steril ederek besleyici diskin oluşturulmasıyla başlar. Lamın üzerine 0,5 mm kalınlığında steril bir silikon kauçuk conta yerleştirin. Conta tarafından lam üzerinde oluşturulan kuyucuğun içine pipetle yaklaşık 300 µL C TT YE besiyeri ekleyin.

C-T-T-Y-E besiyeri agarının üzerine, alevle sterilize edilmiş başka bir lam eğimli bir şekilde yerleştirilmelidir. Lamın eğimli yerleştirilmesi kabarcık oluşumunu önler. Lam yerleştirildikten sonra, düzenek her iki yanına birer adet mini kıskaç takılarak birbirine sabitlenmelidir.

Kırpılmış kompleksi 4 °C'ye yerleştirin ve C-T-T-Y-E ortam agro'sunun donmasını bekleyin. Bu işlem genellikle yaklaşık beş dakika sürer. Agro donduktan sonra, takip analizinde kullanılan plaka kompleksleri hazırlanabilir.

Analiz komplekslerini oluşturmak için slaytları hazırlayarak başlayın. Her kompleks için iki cam mikroskop slaytını alevle sterilize edin. Analizin tabanını oluşturmak için slaytlardan birinin üzerine bir otoklav contası yerleştirin.

Diğer lam, agrosların düzleştirilmesi ve destek lamı olarak kullanılır. Testin üst kısmı bir lameldir. Öncelikle bir mikroskop lamını etiketleme bandı ile sarın, ardından cam lameli alevle sterilize edin ve sterilize edilmiş lamelin üzerine yerleştirin.

Sargılı lam desteklerini, lamelin çatlamasını önleyecek şekilde yukarı kaydırın. Pens yardımıyla alevle sterilize edilmiş lamelin üzerine bir otoklav contası yerleştirin. Alttaki lamın ve lamelin üzerindeki contaların camla sızdırmaz bir şekilde birleştiğinden emin olmak için üzerlerine bastırın.

Aksi takdirde, agar ortamı kuruyabilir. Lam contası ve lameli contası düzeneklerini steril tarafı yukarı bakacak şekilde kenara ayırın; buradan itibaren, agar ortamının katılaşmasını ve bunun sonucunda görüntü kalitesinin düşmesini önlemek için her seferinde yalnızca bir kompleks üzerinde çalışın. Besiyeri diskini yerleştirerek başlayın.

Besleyici disk kompleksini dört santigrat dereceden çıkarın. Bağlama kapağını kaldırın ve artık katılaşmış olan C-T-T-Y-E agarını, 100 mikrolitrelik cam tek kullanımlık uçlu bir mikro örnekleme pipeti kullanarak lamlar üzerinde açığa çıkarın. C-T-T-Y-E besiyeri agarından bir milimetre çapında bir besleyici disk çıkarın ve bunu lamel üzerindeki contanın oluşturduğu kuyucuğa yerleştirin.

Ardından, TPM besiyeri halkalarını inkübatörden çıkarın ve üzerindeki lamelde bulunan contanın oluşturduğu, besleyici diski içeren kuyucuğa 300 µL pipetleyin. TPM besiyeri halkaları, T-P-M-S-A besiyeri halkasını düzleştirecek şekilde yükselmelidir. Alevle sterilize edilmiş, contasız lamlardan birini TPM besiyeri halkalarının üzerine açılı bir şekilde yerleştirin. Lamın açılı yerleştirilmesi, hava kabarcığı oluşumunu önlemeye yardımcı olur.

Kompleksi her iki yanına birer tane gelecek şekilde mini binder klipslerle birbirine sabitleyin. Klipsle sabitlenmiş kompleksi 4 °C'ye yerleştirin ve besiyerinin donmasını bekleyin. Bu işlem genellikle yaklaşık beş dakika sürer.

Agar ortamı donduktan sonra, kompleksi 4 °C'den çıkarın. Mandal klipslerini çıkarın ve kompleksin ucunu sıkın. Bantlanmış lamı gevşetmek için, bantlanmış lamı çıkarın ve daha sonra kullanmak üzere tezgaha yerleştirin.

Ardından, bir penset çiftini kama gibi kullanarak, lamel conta medya dizisi kompleksini destek lamından ayırın ve destek lamını atın. Lamel conta kompleksini ayırmak için kanırtma hareketi uygulamayın; çünkü bu durum lamelin kırılmasına ve/veya medya dizisinin destek lamına yapışmasına neden olabilir.

Destek lamını çıkardıktan sonra, lamel conta medya aray kompleksini, conta tarafı yukarı gelecek şekilde bantla sarılmış lamın üzerine yerleştirin. Yeni açığa çıkan medya agros yüzeyindeki tüm görünür nemin buharlaşmasını sağlamak için bu kompleksi bir bekin yanına yerleştirin. Medya agrosun bir dakikadan daha uzun süre kurumasına izin vermeyin.

Bu durum M Zant'ın sürü davranışını etkileyebileceği için, hücreleri yeni hazırlanan analiz kompleksine ekerek devam edin. Lamel conta medya agros kompleksinden fazla nem buharlaştığında, medya üzerine bırakılmak üzere 0,5 µL konsantre hücre aspire edin. Medya agros'a yaklaşmadan önce pipet ucundaki basıncı düşürün.

Pipet ucunun altında bir hücre damlası belirir, bu da ucun medya agarına temas etmeden hücrelerin yerleştirilmesini kolaylaştırır. Agar yüzeyindeki bir çökkünlük, sürünün davranışını değiştirebilir. Hücreleri, gömülü besleyici diskten yaklaşık bir milimetre uzağa bırakmak için pipeti düz bir şekilde aşağı hareket ettirin.

Ardından pipeti doğrudan yukarıya doğru çekin. Bu şekilde, hücre kümesinin dairesel olması sağlanır. Hücreler yerleştirildikten sonra, hücre noktasının kuruması için kompleksi bekin yanına yerleştirin ve bu işlemi 20 saniyeden fazla sürdürmeyin.

Kurutma işleminden sonra, kompleksin tabanını oluşturan lam conta düzeneğini kapaktaki conta ile hizalayın. Kompleksin üst kısmını oluşturan gasket media acro cell complex'i kaydırarak yerleştirin. Sızdırmazlık sağlamak için hafifçe bastırarak birleştirin.

Yoğuşmayı önlemek amacıyla, herhangi bir kalıntıyı gidermek için lam ve lamelin yüzeylerini bir kim wipe ile temizleyin. Lamları temizledikten hemen sonra, lam aşağıda ve lamel yukarıda olacak şekilde kompleksi ısıtmalı mikroskop tablasına yerleştirin. Eğer yoğuşma oluşmuşsa, görüntüleme yazılımını başlatmadan önce lam kompleksinin ısıtmalı tabla üzerinde birkaç saniye beklemesine izin verin.

Videoyu hazırlamak için mikroskopta uygun objektifi, 2x, 4x veya 10x olanı seçin. Kamerayı ve mikroskobu açın ve ışığın çok yoğun olmadığından emin olmak için ışık seviyelerini kontrol edin. Bilgisayarı başlatın ve görüntüleme programını açın.

Canlı görüntü penceresine tıklayın ve mikroskobu odaklayın. Görüntü, burada gösterilene benzer şekilde görünecektir. Görüntüleri toplamaya başlayın.

Besiyeri agarı çökmeye eğilimli olduğundan ve bu durum odağın kaymasına neden olduğundan, ilk saat boyunca odağı düzenli olarak kontrol ettiğinizden emin olun. Görüntüleme işlemi tamamlandığında, elde edilen görüntüleri depolama için aktarın. Sürgü kompleksini, gece boyunca %90 etanol içinde bekleterek parçalayın veya contaları yeniden kullanmak için TOLA işlemi uygulayın.

Bu hızlandırılmış çekim videosu, burada açıklanan takip deneyi uygulanan em'leri göstermektedir. Görüntü yakalama hızı 20x büyütmede dakikada bir görüntü, oynatma hızı ise saniyede 60 görüntüdür. Bu hızlandırılmış çekim videosu, hücrelerin %1'inin GFP eksprese ettiği bir eant hücre popülasyonunu göstermektedir.

Video, dönüşümlü faz kontrastlı ve floresan görüntülerin birleştirilmesiyle oluşturulmuştur. Analiz, %1 Aros içeren C-T-T-Y-E üzerinde gerçekleştirilmiştir; görüntü yakalama hızı 100 x büyütmede dakikada bir görüntüdür. Bu zaman ayarlı video, M Anthes'in kayma hareketliliğini göstermektedir.

Bu analiz %1 Aros içeren C-T-T-Y-E üzerinde gerçekleştirilmiştir. Görüntü yakalama hızı, 100 x büyütmede dakikada bir görüntüdür. Bu TimeLapse videosu P OSA seğirme motilitesini göstermektedir. Bu analiz %1 Aros içeren LB üzerinde gerçekleştirilmiştir; görüntü yakalama hızı dakikada bir görüntüdür.

20x büyütmede oynatma hızı saniyede 60 görüntüdür. Bu hızlandırılmış video, Smar senslerinin sürü hareketliliğini göstermektedir. Bu analiz, LB ve %1 Aris üzerinde gerçekleştirilmiştir ve yakalama hızı dakikada bir görüntüdür.

20 x büyütmede oynatma hızı saniyede 60 görüntüdür. Bu hızlandırılmış film, EGT kayma hareketliliğini göstermektedir. Bu analiz LB içinde %0,5 agarozda gerçekleştirilmiştir; yakalama hızı dakikada bir görüntüdür; lv'deki %0,5 agarozun kırılganlığı nedeniyle 20 x büyütmedeki oynatma hızı saniyede 120 görüntüdür.

Bu analizde, şekil 1 B'de görülen daha büyük contalar kullanılır. Bakteriyel biyofilmlerin zaman atlamalı (time-lapse) videolarının nasıl oluşturulacağını az önce gösterdik. Bu prosedürü uygularken, tutarlı sonuçlar elde etmek için acele etmemek ve mümkün olduğunca hassas çalışmak önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.