Radyasyondan aşağıdaki γH2AX Mekansal Dağılımı Değerlendirilmesi

Merhaba, ben Baker IDI Kalp ve Diyabet Enstitüsü'nde doktora çalışmalarımı yürüten Raja Ti. Sizi, yeni bir kalp hücresinde DNA hasarını ve kromatin kondansasyonunu belirten Doğu modifikasyonunun 3D illüstrasyonunda yer alan adımlar boyunca yönlendireceğim. DNA, nükleer bölgelerin etrafına sarılmıştır.

Her bir nükleozom, dört farklı histon türünden oluşur: H2A, H2B, H3 ve H4. DNA kırıklarının oluşumu, H2AX'in fosforilasyonu ile işaretlenir. H2AX'in bu fosforilasyonu, temel olarak H3K4'ün metilasyonu ile işaretlenen bölgelerde meydana gelir. Şimdi, fosforile H2AX ve metillenmiş H3K4 ile immün etiketlenmiş hücrenizdeki modifikasyonların 3D illüstrasyonuna bakacağız.

Hadi başlayalım. Hücre süspansiyonundan E kursunu 15 mil. Falcon tüplerine yerleştirerek başlıyoruz. S, 1.50 G'de santrifüjle iki kez PB ile yıkanır ve resüspande edilir.

Radyasyonun hücresel olaylar üzerindeki anlık etkisini gözlemlemek için taze Besiyeri içinde süspanse edin. Hücreleri radyasyon öncesinde ve sırasında beş ila 10 dakika boyunca gözlerin üzerinde tutun. Hücreleri gama radyasyonuna veya x-ışınlarına maruz bırakın. Radyasyon sonrası, hücre süspansiyonunun üç mililitresini altı adet GU'nun her birine dağıtın.

Peak gamma H2X için kuyucuklu plaka; hücreleri 37 °C'de 30 dakika ile bir saat arasında inkübe edin. Adherent olmayan hücreleri cam lamlar üzerine yerleştirmek için Cytospin düzeneği kullanıyoruz. Cytospin klibini monte ederken, tüm filtre kartının huni ile örtüştüğünden emin olun.

Her bir sitosinle karşılaştırma yapılan bölgeye 50 µL hücre süspansiyonu damlatın; sitosin klipslerini sitosinle karşılaştırma yapılan düzeneğe yerleştirin ve 500 RPM hızında beş dakika santrifüj edin. Sitosin klipslerini çıkarın ve lamları filtre kartından ayırın. Hücrelerin havada çok uzun süre kurumasına izin vermeyin, çünkü bu durum floresan boyamadaki arka planı etkileyebilir.

Sıvı bloklama pini kullanarak her bir yaymanın etrafına daireler çizdikten sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca %4 paraformaldehit ile fikse ediyoruz. Etanol veya yağ ile karşılaştırıldığında, %4 paraformaldehit ile daha iyi bir fiksasyon gözlemlenmiştir. PPS lamlarını, oda sıcaklığında beş dakika boyunca Triton X 100 ile permeabilize ediyoruz.

Twin 80 ile karşılaştırıldığında, Triton X 100 ile hücrelerde daha iyi bir sinyal gözlemledik. Hücreleri PP S3 ile her seferinde beş dakika boyunca izleyin. Hücreleri, diğer bloklama ajanları ve süreleriyle karşılaştırıldığında, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %1 BSA içinde bloklayın ve bu işlemi üç kez tekrarlayın.

BSA, primer antikorların spesifik olmayan bağlanmasını en aza indirmede en etkili olan maddeydi; %1 BSA içeren ve 1/500 oranında seyreltilmiş iki primer antikoru, her slayt başına yaklaşık 50 microliters primer antikor olacak şekilde kullandık. Primer antikorun oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edilmesi, dört degrees centigrade'de gece boyu inkübasyona kıyasla arka plan boyanmasını azaltır. Hücreleri PBS ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın.

Alexa floor 4 88, iyi bir anti-fare ve Alexa floor 5 46 ise anti-tavşan antikorudur. Farklı markörleri aynı anda saptamak için sekonder antikorlar kullanılmıştır. Farklı türlerde üretilmiş antikorlar kullanın.

Her lam üzerine yaklaşık 50 µL seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 90 dakika boyunca inkübe edin. Hücrelerin ve antikorun kurumasını önlemek için hücrelerin nemli bir inkübasyon haznesinde inkübe edilmesi önerilir; ardından lamları 3 kez beşer dakika boyunca PBS ile yıkayın.

Her bir lama, PBS içinde 1/500 oranında seyreltilmiş topo üçten 50 µL eklendi. Lamlar, beşer dakikalık üç yıkama şeklinde PBS ile yıkandı. Lamlar üzerindeki fazla nem uzaklaştırıldı ve Antifa çözeltisi eklendi.

Antifa solüsyonu eklemeden önce hücrelerin tamamen kurutulmaması önerilir. Lamın üzerine bir kapatma camı yerleştirin. Herhangi bir hava kabarcığı oluşumunu önlemek için dikkatli olunmalıdır.

Lamları karanlık ve nemli bir odacıkta gece boyunca bekletin. Hücrelerin kurumasını önlemek için lamı oje ile mühürleyin. Konfokal mikroskop ile elde edilen görüntüler şunu ortaya koymaktadır.

Daha iyi uzamsal çözünürlük elde edilmiş ve görüntüleme için helyum lazeri kullanılmıştır. Daha yüksek veya daha düşük büyütmeli lensler yerine 63'lük yağ daldırma objektif lensleri tercih edilmiştir. Üç veya dört katlık bir zoom faktörü, daha yüksek çözünürlüklü bir görüntü sağlayacaktır.

Birçok hücreden FO sayımı yapmak için sekiz tarama hızı ve 1024 x 1024 piksellik bir görüntü boyutu kullanılması tercih edilir. Çoklu kanallar için görüntüleme yapılırken, kare tarama yerine sıralı hat tarama kazanımı önerilir. Numune ağarmasını önlemek için detektör kazancı ve amplifikatör ofseti, gürültüyü ve sinyal doygunluğunu azaltacak şekilde ayarlanır.

Kama HX X four boyutunun 0,5 mikrometreden daha küçük olabileceği göz önünde bulundurularak, görüntülerin en az 0,5 mikrometre çözünürlükte alınması önerilir. Jet ekseni boyunca adım boyutu görüntüleri, mark first ve mark lost deseni kullanılarak bir jet serisi düzeninde gereklidir. Farklı proteinler arasındaki mekansal ilişkiyi göstermek için, metamor first kullanılarak 2048 x 2048 piksel görüntü boyutu ve altı tarama hızı kullanılması önerilir.

İkincisi, çeşitli konfokal mikroskoplarda elde edilen görüntülerden sayılabilir. Gamma hgx görüntü etiketlerini doğrudan dosya menüsünden veya fatura numaralarını kullanarak açın. Etiketler. İşlem menüsüne gidin ve Yığın aritmetiğini seçin.

Maksimum projeksiyonu seçin ve dahil edilecek planları belirleyin. Ardından tamam'a tıklayın. Şimdi top hat işlemini seçin ve kaynak görüntü olarak Gamma H2X görüntüsünü belirleyip uygulayın.

Top hat filtresi ve elde edilen görüntü, daha az gürültüye ve odak noktası yoğunluğunda azalmış varyasyona sahip ikili bir görüntü olacaktır. Regions sekmesine gidin, bölge çizim aracını seçin ve çekirdeklerin etrafına bölgeler çizin. Process menüsüne gidin ve görüntüyü eşikleyin (threshold).

Dahil etme eşiğini seçin ve alt ile üst eşik değerlerini belirleyin. Genellikle dört sayıyı etkileyen şey eşik değerleridir. Optimal eşik değeri, arka planın dahil edilmesini minimize eden ve foray dahil edilmesini maksimize eden değerdir.

Bu işlem, farklı eşik değerleri kullanarak foray sayısı sayımı yapılarak en iyi şekilde gerçekleştirilebilir. Ardından, foray sayısı çıplak gözle yapılan sayım ile karşılaştırılır. DPI görüntüsünü seçin, bölgeler menüsüne gidin ve bölgeleri aktar seçeneğini belirleyin.

Artık sayım için hazır olan karşılıklı foray ve nükleer görüntülerimiz mevcut. Nükleer bölgelerin çoğu top hat filtresine aktarılmıştır. Measure menüsüne gidin ve integrated ary analysis veya IMA'yı seçin. Tüm bölgeleri ölçmek için Measure all regions seçeneğini belirleyin ve FTE sayısını elde etmek için measure düğmesine tıklayın.

Artık her bölgeden elde edilen FTE sayıları, Log verileri seçeneği kullanılarak bir hesap tablosuna aktarılabilir. Her kanal için önceden oluşturulmuş jet projektör görüntülerini açın. Görüntüleme sekmesine gidin ve renk hizalamayı seçin.

Üç kanal için birleşik bir görüntü oluşturmak amacıyla her bir kanal için ilgili kaynak görüntüleri seçin. Çekirdekteki farklı belirteçlerin mekânsal konumlandırmasını göstermek için çizgi tarama analizi gerçekleştirilir. Ölçüm araç çubuğu komutuna gidin ve çizgi tarama analizini seçerek hücre boyunca bir çizgi çizin.

Bu işlem, hat boyunca her kanalın floresan yoğunluğunu gösteren bir grafik oluşturacak ve farklı işaretleyicilerin birbirlerine göre olan mesafesini temsil edecektir. Bir yığından 3D görüntü oluşturmak için yığın menüsüne gidin ve 3D rekonstrüksiyon seçeneğini belirleyin. 3D rekonstrüksiyon tipi olarak maksimumu seçin.

Rotasyon planını seçin, jet kalibrasyon mesafesini belirleyin. Genellikle kullanıcı, 3D rekonstrüksiyon oluşturmak için tamam'a tıklar. Ve böylece immunofloresan boyama ve görüntü analizi protokolümüz sona ermiş olur.

Özetle, immünofloresan konfokal mikroskopi, hücre çekirdeğindeki farklı C markerlarının ve gamma H2AX odaklarının üç boyutlu görselleştirilmesi için kullanılan iki tekniktir. İzlediğiniz için teşekkürler.