Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

Bu prosedürün genel amacı, taze ürünlerden yapışkan bant tabanlı örnekleme yöntemini, FISH (floresan yerinde hibridizasyon) olarak da bilinen hızlı floresan in situ hibridizasyon yöntemi kullanılarak salmonella türlerinin tüm hücre moleküler tespiti ile birleştirmektir. Bu işlem, önce yapışkan bandın istenen malzemeye uygulanması ve yüzeye bağlı hücrelerin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Hücre yüklü bantlar doğrudan analiz edilebilir veya katı veya sıvı faz zenginleştirmelere tabi tutulabilir.

Prosedürün ikinci adımı, besiyerinde çözünmüş veya zenginleştirilmiş hücreler için bant üzerinde fiksasyon ve bir etanol serisi ile dehidrasyondur. İkinci adım, süspansiyonda hücre fiksasyonunu ve ardından hücrelerin saklama tamponunda yeniden süspansiyonunu içerir. Prosedürün üçüncü adımı, salmonella'ya özgü bir oligonükleotit prob kokteyli kullanarak bant üzerinde hızlı bir hibridizasyon adımı gerçekleştirmek ve ardından fazla probun bir yıkama tamponu ile durulanarak uzaklaştırılmasıdır; FISH yöntemiyle analiz edilen örnekler için FISH adımı süspansiyonda gerçekleştirilir ve fazla prob, analizden önce basit bir dilüsyon adımı kullanılarak uzaklaştırılabilir.

Prosedürün son adımı, hibridize edilmiş bantlı hücrelerin DPI ile karşı boyanması ve floresan mikroskobu kullanılarak incelenmesidir. Gerçeklere dayalı analizler için karşı boyama gerekli değildir. Sonuç olarak bu yöntem, örneklenen taze ürünlerde bulunabilecek salmonella türlerinin görsel veya sitometrik tespiti için bir araç sağlar.

Bu yöntemle ilgili ilk fikrim, Romalı aero taşı kalıntılarındaki bakteri topluluklarını incelemek için benzer bir yaklaşım kullanan İtalyan bir grup hakkında okuma yaparken ortaya çıktı. Ancak r ve ben, gıda mikrobiyolojisinde hızlı yöntemler üzerine verdiğim bir derste bu çalışma üzerine bir tartışma yürüttük. Birkaç hafta sonra, taze ürünlerden kaynaklandığı belirlenen bir salmonella salgını başladı ve sonuç olarak 43 farklı eyalette yaklaşık 1500 kişiyi hastalandırdı.

Deneysel yaklaşımımız, taze ürünlerdeki spesifik bakteri türlerinin tespiti için güncel ve pratik bir yol sunarken, aynı zamanda sahada veya gıda üretim ortamında test yapmaya olanak tanıyacak kadar taşınabilirdir. Örnekleme için kullanılacak bir bant seçerek başlayın. Seçenekler arasında, steril olan ve kullanım kolaylığı için paketlenmiş olarak sunulan, ticari olarak temin edilebilen mantar bantları veya kontak bantlar yer almaktadır.

Steril bir alüminyum şablon kullanarak, 10 cm uzunluğundaki bir yapışkan bandın yapışkan olmayan tarafına kalıcı bir markör ile bir santimetrelik kareler çizin. Bu, bandın hangi kısmının gıdayı veya çevresel yüzeyi örneklemek için kullanıldığını not etmek için görsel bir kılavuz görevi görecektir. Bandı, yapışkan yüzü örneklecek yüzeye bakacak şekilde C şeklinde bir döngü oluşturun. Bunu yapmak için, yapışkan uçları başparmak ve orta parmakla tutun ve işaret parmağını bandın arkasındaki çizili karenin üzerine yerleştirin.

Bandı örneklenecek yüzeye yerleştirin ve bandın kenarlarını bırakmadan işaretli alanı yüzeye hafifçe bastırın. Bandın yapışkan tarafının örnek yüzeyiyle tam temas ettiğinden emin olmak için işaret parmağını kullanın. Düzenli bir hareketle hava kabarcıkları oluşmasını önleyin.

Bandı örneğin üzerinden yavaşça çekin. Yüzeye tutunmuş mikropların fiziksel olarak çıkarılması hücre yükünü sabitler. Genel amaçlı şeffaf ofis bandı kullanarak, düz ve kırışıklık içermeyen bir yüzey oluşturmak için bandın uygun şekilde gerilmesini ve esnetilmesini sağlayarak yapışkan tarafı yukarı gelecek şekilde bir cam mikroskop lamı üzerine yerleştirin.

Bu işlem, bandın deforme olması veya kıvrılmasıyla ilgili sorunların en aza indirilmesine yardımcı olacaktır. Sonraki ısıtma işlemi sırasında. Hibritleme sırasında, örneklenen hücrelerin agri yüzeyiyle doğrudan temas etmesini sağlamak ve bandın agri yüzeyinden kolayca kaldırılmasını kolaylaştırmak için bandı xylose slicing tertile four veya XLT four agri plakalarının üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin.

Zenginleştirme işleminin ardından, bandın şablonlanmış örnek temas kısmı agri yüzeyine sıfır olacak şekilde yerleştirilir ve bandın bir ucu hafifçe yapıştırılır. Yoğuşmayı önlemek için Petri kutularının yan duvarları ters çevrilir ve 35 °C'de inkübe edilir. Salmonella türlerinin yeterli büyümesini sağlamak için, hücreleri saptanabilir bir düzeye zenginleştirmek amacıyla gereken inkübasyon süresi, başlangıçtaki salmonella kontaminasyon seviyelerine bağlı olacaktır.

İstenen zenginleştirme süresinin ardından agar plağını açın; bant inkübasyon sırasında yapışkanlığını koruyacaktır. Bant-agar arayüzünde oluşan mikro kolonilerin maksimum düzeyde geri kazanılmasını sağlamak için bandı işaret parmağınızla nazikçe agara bastırın, ardından bandı Petri kabının duvarına yapışık olan kenarından tutarak yavaş ve düzgün bir hareketle çıkarın. Standart şeffaf ofis bandı kullanarak, hücre yüklü bandı düz ve kırışıklık olmayan bir yüzey oluşturacak şekilde yapışkan tarafı yukarı gelecek şekilde bir mikroskop lamı üzerine monte edin.

Örnek temas alanını 500 µL %10 nötral tamponlu formalin ile kaplayarak, 25 °C'de 30 dakika boyunca bant üzerinde hücre fiksasyonu gerçekleştirin. Tahriş edici veya toksik buhara maruz kalmayı en aza indirmek için fiksatif malzemeyi kimyasal çeker ocak altında sızdırmaz bir kaba boşaltın; bandı, yüzeyini hafifçe PBS ile yıkayarak bir kez 1x fosfat tamponlu salin veya PBS ile yıkayın ve örneğiydehidre edin. Progresif bir etanol serisi kullanarak, ticari moleküler biyoloji sınıfı solüsyonlarla pre-hibridizasyon, hibridizasyon ve yıkama tamponları hazırlayın; bunları 0,22 µm şırınga filtresinden geçirin ve hibridizasyon ile yıkama tamponlarını 55 °C'ye önceden ısıtın.

Probe kokteylinin final konsantrasyonu mikrolitre başına beş nanogram olacak şekilde, önceden ısıtılmış hibridizasyon tamponuna floresan işaretli oligonükleotid probları ekleyin; bandın kalıp örneği temas alanının üzerini, prob kokteyli içeren 300 mikrolitre hibridizasyon tamponu ile kaplayın ve hibridize edilen banda bağlı hücreleri, slayt modu cihazı gibi doğrudan temaslı bir inkübatör için 55 derece Celsius'ye ayarlanmış nemli, sızdırmaz bir inkübasyon odasında 15 dakika boyunca hibridize edin. Hibridizasyonun ardından slaytlar çıkarılır ve prob içeren hibridizasyon tamponu tabakası atılır. Pipetleme yoluyla önceden ısıtılmış yıkama tamponu ile kısa süreli ve nazikçe durulayın.

Salmonella türlerinin floresan mikroskobu ile tespiti için, eğik bir lam üzerine küçük bir hacimde tampon eklenerek lamların havada kuruması sağlanır. Lamın üzerine, nükleer karşıt boya olan dpi içeren montaj ortamı Vector Shield H 1200'den yaklaşık 10 µL ekleyin ve karanlıkta 10 dakika boyunca inkübe edin. Lamel üzerine imersiyon yağı damlatın ve örnekleri yüksek büyütmeli bir yağ objektifi kullanarak inceleyin.

Numuneyi odaklamak için DPI filtresi kullanılır. Daha sonra mikroskop uygun filtreye geçirilir ve probları etiketlemek için hangi boyanın kullanıldığına bağlı olarak salmonella hücreleri, yeşil veya kırmızı floresanlarına göre görsel olarak skorlanır. Sitometrik tespit için PBS süspansiyonundaki numuneler beş mililitrelik yuvarlak tabanlı örnekleme tüplerine aktarılır ve 647 nanometre eksitasyona sahip bir akış sitometresi kullanılarak incelenir.

Verileri FlowJo yazılımını kullanarak analiz edin. Yapay olarak kontamine edilmiş bir domatesin yüzeyinden terica serovar, Ty Murium'un yapışkan bant ile örneklenmesi, mikroskopi veya akış sitometrisi hücre yüklemesi yoluyla doğrudan analiz sonrası işlemi kolaylaştırır. Bantlar, bant üzerindeki salmonella hücrelerinin başlangıç yerel konsantrasyonuna bağlı olarak, salmonella'ya özgü DNA probları kombinasyonu kullanılarak hızlı floresan C iki hibridizasyonu için işlenmiş ve Texas Red ile işaretlenmiştir.

Katı faz zenginleştirme, izole mikro kolonilerden konfluen büyümeye kadar değişen sonuçlar vermiştir. Bantla örneklenen hücreler, örneklemeden hemen sonra veya beş saatlik sıvı yüzey inkübasyonunu takiben, kombine FISH ve akış sitometrisi ile analiz edilebilmiştir. 35 °C'de mini kültür zenginleştirmesi.

Tape fish tekniğinin gıda güvenliği için kullanımını açıklamış olsak da, bu yöntemin çevre mikrobiyolojisi, bitki patolojisi veya klinik mikrobiyoloji dahil olmak üzere diğer disiplinlerde de kullanım için yüksek potansiyeli vardır. Bu prosedürle paralel olarak, banttan çıkarılan örneklerin katı veya sıvı faz zenginleştirmeleri üzerinde biyokimyasal testler veya PCR gibi ek deneyler gerçekleştirilebilir. Testler, fish prosedürünün kapsamı dışında kalan ve mevcut olabilecek salmonella hakkındaki soruları yanıtlamak için kullanılabilir.