Bromodeoxyuridine (BrdU) Etiketleme ve Çözünmüş Organik Kültür bağımsız Kimlik sonraki Floresan Aktive Hücre Sıralama Karbon-aşağılayıcı Bacterioplankton

Mikroplar, Racine ve sucul ortamlar gibi birçok çözünmüş organik karbon substratının veya DOC bileşiğinin bozunmasını gerçekleştirir. Mikropların DOC dönüşümündeki rolünü tam olarak anlamak için, taksonomilerinin ve fonksiyonlarının eş zamanlı olarak tanımlanması gereklidir. Bu video, sucul ortamlarda belirli DOC havuzlarını dönüştüren serbest yaşayan bakterilerin veya bakteriyel planktonların taksonomik tanımlamasına yönelik bir prosedürü göstermektedir.

Bir test ortamından toplanan su örnekleri işlenir ve ilgilenilen bir bileşik ile yeni sentezlenen DNA'ya ve aktif olarak büyüyen hücrelere dahil olan bromo deoksiüridin, BRDU ile inkübe edilir. Ardından, BRDU işaretli bakteri planktonları, ZI konjuge anti-BRDU antikorları ile işaretlenir. Yüksek düzeyde BRDU işaretlemesine sahip bakteri planktonları, floresanla aktive edilen hücre ayıklama yöntemiyle izole edilir.

Ardından, ayrıştırılan hücrelerden DNA ekstre edilir ve PCR tabanlı 16 s ribozomal RNA gen analizi sonuçlarına dayanarak taksonomik tanımlama gerçekleştirilir. Merhaba, ben Kent State Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'ndeki Dr. Chen Mao'nun laboratuvarından Steven Robbins. Bugün size sucul ortamlardaki DOC degrade eden bakteriyel planktonların tanımlanması için kültürden bağımsız bir yöntem göstereceğiz.

Bu tekniğin, besin takviyeleri ve ardından bakteriyel topluluk DNA'sı analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, analizi yüksek derecede aktif bakterilere odaklaması ve uyku halindeki veya yavaş büyüyen hücreleri hariç tutmasıdır. Burada, belirli bir DOC bileşiğini kullanan bakteri planktonlarının tanımlanmasını gösteriyoruz. Ancak bu yöntem, diğer tekil DOC bileşiklerini veya alg eksudaları gibi DOC gruplarını kullanan bakteri planktonlarını incelemek için de uygulanabilir.

Öyleyse bazı su örnekleri alalım ve başlayalım. DOC degrade eden bakteriyel planktonlar için su örneklerini analiz etmeden önce, su örnekleri uygun şekilde işlenmelidir. Burada gösterilen örnekler, sudaki büyük partikülleri ve ER VRE'leri uzaklaştırmak amacıyla Georgia kıyılarından toplanmıştır.

Toplama karboyundaki suyu, bir mikrometre gözenek boyutuna sahip bir filtre içeren filtrasyon ünitesine aktarmak için peristaltik bir pompa kullanın. Ardından, filtrattan 36 mililitrelik alikotları, her biri taze hazırlanmış %10 Paraform aldehit çözeltisinin dört mililitresini içeren üç adet steril 50 mililitrelik polipropilen tüpe aktarın. İnkübasyon sonrası hücreleri korumak için oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin.

Suyu, 0,22 mikrometre gözenek boyutuna sahip beyaz membran filtreli bir cam vakum filtrasyon ünitesinin filtrasyon kulesine dökün ve çözeltiyi çekmek için vakumu uygulayın. Vakum filtresinden 10 mililitre PBS geçirerek filtreyi yıkayın. Filtreleri negatif kontrol olarak etiketleyin ve minus 20 degrees Celsius sıcaklıkta saklayın.

Deneysel bir ekosistem veya mikrokozmos oluşturmak için, önceden durulanmış altı adet bir litrelik cam erleni 800 mililitre önceden filtrelenmiş su örneği ile doldurarak başlayın. Her bir mikrokozmosa, final konsantrasyonu 10 micromolar olacak şekilde BRDU ekleyin. Karıştırmak için erleni elinizle hızla döndürün.

Her bir örnek üç paralel şeklinde analiz edilecektir. Bu nedenle, mikrokozmoslardan üçüne model DOC bileşiği ekleyin. Burada, mikrokozmoslara 100 nanomolar final konsantrasyonda reine eklenmektedir.

Ardından diğer üç mikrokozmosa steril PBS ekleyin. Bunlar DOC içermeyen kontroller olarak hizmet edecektir; tüm mikrokozmosları, in situ sıcaklığı olan 25 °C'de, karanlıkta, 100 RPM hızında çalışan bir çalkalamalı inkübatöre yerleştirin. Burada 0, 8, 16 ve 24. saatlerdeki zaman noktalarında ölçümler yapın.

Her bir mikrokozmostan 36 mililitre örneği, dört mililitre taze %10 paraformaldehit içeren 50 mililitrelik steril polipropilen tüplere toplayın ve hücreleri sabitlemek için oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. Ardından, korunan hücreleri 0.22 mikrometre gözenek boyutuna sahip beyaz membran filtrelerden süzün. PFA kalıntılarını temizlemek için vakumlu filtre üzerinden 10 mililitre PBS uygulayın.

Hemen INS situ immün saptamaya geçin veya bakteriyel planktonlardaki BRDU inkorporasyonunu analiz etmek için filtreleri -20 °C'de saklayın. Bakteriyel hücre duvarını bozmak için örnek filtrelerini oda sıcaklığında muamele ederek başlayın. Filtreyi bir filtrasyon ünitesine yerleştirin, ardından hücrelerin üzerini kapatacak şekilde filtre üzerine 1 mL lizozim çözeltisi pipetleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, çözeltiyi uzaklaştırmak için vakum uygulayın. Çözelti filtreden geçtikten sonra, 10 mililitre PBS ekleyerek hücreleri yıkayın ve vakum uygulayın. Daha sonra, hücre duvarını daha fazla zayıflatmak için filtre üzerindeki hücreleri kaplayacak şekilde bir mililitre proteinaz K çözeltisi ekleyin.

Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Tek katmanlı DNA elde etmek için PBS ile yıkayın. Filtre üzerindeki hücreleri kaplayacak şekilde bir mililitre ekzonükleaz çözeltisi ekleyin.

37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, vakum filtresinden 10 mL PBS geçirerek filtreyi yıkayın. Ardından, hücre içermeyen kısımları temizlemek için filtrenin kenarlarını kesin.

Ardından alkolle temizlenmiş kuru bir yüzey üzerinde, steril bir bıçak kullanarak filtreyi sekiz eşit parçaya bölün. Her örnek için sekiz adet çerçeve sızdırmaz inkübasyon odası gereklidir; filtrenin sekizde birini, örnek tarafı yukarı gelecek şekilde monte edilmiş çerçeve sızdırmaz inkübasyon odasına yerleştirin. Odalar monte edildikten sonra, in situ A-B-R-D-U etiketli hücreleri saptamak için Roche Intu hücre proliferasyon kiti florları kullanın.

Bekleme prosedürleri tamamlandığında, filtre bölümünü inkübasyon odasından çıkarın ve steril bir yüzeye yerleştirin; steril bir bıçak kullanarak filtre bölümünü küçük parçalara ayırın. Filtre parçalarını, içinde 1 mL PBS bulunan iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın, tüpü sıkıca kapatın ve parafilm ile mühürleyin. Ardından tüpü, sarsıntılı bir inkübatörde 37 °C'de ve 200 RPM'de 10 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından tüpü sabitleyin ve maksimum hızda vorteksleyin. Beş dakika boyunca, SUP süpernatanını steril 15 mililitrelik bir polipropilen tüpe pipetleyin. Daha sonra filtreyi PBS içinde yeniden süspanse edin ve her örnek için süpernatantı aynı 15 mililitrelik tüpe ekleyerek vorteksleme ve inkübasyon adımlarını iki kez daha tekrarlayın.

Yeniden süspanse edilen hücreleri dört derece Celsius'ta saklayın. Örnek, iki gün içinde analiz edilmelidir. Son olarak, yüksek düzeyde BRDU inklüzyonuna sahip popülasyonu elde etmek için hücreleri ayırın.

Burada, bir BD FACS Aria akış sitometresi ve ilgili yazılım kullanılmaktadır. Hücreler ayrıştırıldıktan sonra, BRDU ile zenginleştirilmiş popülasyonun taksonomik kimliğini belirlemek için analiz yapılabilir. Ayrıştırılan bakterilerin 16S ribozomal RNA genlerini çoğaltmak amacıyla filtre PCR'lar gerçekleştirmek için, ayrıştırılmış hücreleri beyaz 0.22 gözenek boyutuna sahip bir polikarbonat membran filtreye pipetleyin ve vakum pompasını çalıştırın; ardından steril bir bıçak kullanarak filtrenin hücre içermeyen kenarlarını kesin.

Filtreyi her bir koşul için dört eşit parçaya bölün, hücrelerin tüpün içine bakacak şekilde tek bir filtre parçasını üç PCR reaksiyon tüpünün her birine yerleştirin. 45 µL PCR sınıfı su ekleyin. Filtre kesitinin suyun içinde tamamen batmasını sağlayın.

Ardından, iki adet Roche illustra pure T ready to go PCR boncuğu ekleyin ve boncukların çözünmesine yardımcı olmak için kısa süreliğine vorteksleyin. Daha sonra, ikişer mikrolitre ileri ve geri 16 s ribozomal RNA geni primeri ekleyin.

Amplifikasyon inhibitörlerinin absorbe edilmesine yardımcı olmak için bir mikrolitre BSA veya bir mikrolitre su ekleyin. PCR amplifikasyonunu bir termal döngüleyici cihazda gerçekleştirin. Bağlanma sıcaklığının her döngüde 62'den 52 derece Celsius'a birer derece Celsius azaldığı ve ardından 52 derece Celsius'ta 15 döngü ile devam ettiği bir touchdown PCR programı önerilir.

PCR amplifikasyonunu, bromür boyalı %1 Agros jelleri üzerinde elektroforez ile doğrulayın; PCR amplikonlarını jelden kesin ve bir KaiGen cayo quick gel extraction kiti ile temizleyin. PCR jel saflaştırmasından sonra, aynı örneğe ait amplikonları bir araya getirin. Saflaştırılmış 16 s ribozomal DNA amplikonları artık bir dizi moleküler analiz için hazırdır.

Örnekler, Georgia'nın kıyı şeridinden toplanmış ve bu videoda açıklanan prosedürler izlenerek Racine degrade eden bakterileri incelemek üzere işlenmiştir. Racine, deniz ortamlarında yaygın olarak bulunabilen poliamor bir bileşiktir. Burada gösterildiği gibi, deniz bakterileri için bir besin ve enerji kaynağı görevi görebilir.

Numunelerin gerçek analizleri, 24 saatlik inkübasyonun ardından Racine katkılı mikrokozmlarda, BRDU inklüzyon derecesiyle pozitif ilişkili olan daha yüksek FXI floresan yoğunluğuna sahip bir bakteri grubunun geliştiğini ortaya koymuştur. Bu hücreler, yüksek BRDU inklüzyonlu hücreler veya HI olarak adlandırılmış olup, çoğunlukla Racine degrade eden bakteriler içermelerinin beklendiği saptanmıştır. HI tespit edilmemiştir.

Herhangi bir ekleme yapılmayan kontrol gruplarında, BRDU inklüzyon seviyeleri daha düşük olan ve lii hücreleri olarak adlandırılan hücreler tespit edilmiştir; bu hücrelerin temel olarak kullanımı mümkün olmayan bakteriyel planktonlar içermesi beklenmekteydi. Eklenen Racine HI hücreleri ayrı tüplere ayrılmış ve ardından membran filtrelere toplanmıştır. Filtre PCR işlemi sonrası kısmi 16 ribosomal RNA geni amplikonları elde edilmiş ve jel elektroforezi ile doğrulanmıştır.

Ayıklama filtresinin ardından, ayıklanan hücreler arasındaki fonksiyonel çeşitliliği incelemek için fonksiyonel genlerin PCR amplifikasyonu da gerçekleştirilebilir. Floresan aktivasyonlu hücre ayıklama ve BrDU inkorporasyonunu birleştiren bir yaklaşım kullanarak, su ortamındaki fonksiyonel bakteri hücrelerinin fiziksel olarak nasıl ayrıştırılacağını ve tanımlanacağını size göstermiş olduk. BrDU'nun sağlık açısından riskli olduğunu unutmayın; bu prosedür uygulanırken her zaman laboratuvar önlüğü ve eldiven giyilmelidir.

Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.