Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Akciğer Doku Mikro-Mekanik Karakterizasyonu

Aşağıdaki deneyin genel amacı, atomik kuvvet mikroskopisi mikro indentasyonu kullanarak taze akciğer dokusunun yerel elastik özelliklerini doğrudan ölçmek suretiyle, akciğer parankiminin yerel mekanik ortamını yerleşik hücrelerle ilgili bir mekansal ölçekte karakterize etmektir. Bu işlem, agar ile şişirilmiş fare akciğer dokusunun bir jilet veya skalpel bıçağıyla kesilerek beşer milimetre uzunluk ve genişliğinde, 400 µm kalınlığında akciğer parankimi şeritlerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, fikse edilmemiş ve permeabilize edilmemiş akciğer dokusu şeritleri, AFM mikro indentasyonu için ilgi çekici bölgeleri belirlemek amacıyla immün boyamaya tabi tutulur.

Ardından, oda sıcaklığında PBS içerisindeki doku şeritlerine FM mikro indentasyon uygulanır. Taze akciğer dokusunun yerel elastik özelliklerini doğrudan ölçmek amacıyla sonuçlar elde edilir. Bu sonuçlar, normal ve fibrotik akciğer parankimindeki doku sertliğinin aralığı ve dağılımında çarpıcı farklar olduğunu ve özellikle fibrotik akciğer örneği içerisinde sertlikte büyük mekansal varyasyonlar bulunduğunu göstermektedir.

Bir FM mikro indentasyon kullanılarak elde edilen zorlanmış yer değiştirme eğrilerinden çıkarılan sertlik haritalarına dayanmaktadır. Bu tekniğin, doku şeridi germe gibi mevcut ölçümlere göre temel avantajı, doku sertliğindeki mikro ölçekli varyasyonlara ilişkin benzersiz bir bakış açısı sunarak benzeri görülmemiş bir uzamsal çözünürlük sağlamasıdır. Bu ölçüm, sertliğin doku içinde uzamsal olarak nasıl değiştiği ve hastalıktaki sertlik değişimlerinin kapsamı ile uzamsal ölçeği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Doku yeniden şekillenmesiyle sonuçlanan süreçlar. Akciğer dokusu şeritleri hazırlamak için, izole fare akciğerlerini şişirerek kesim için akciğer yapısını stabilize ederek başlayın. Vücut ağırlığının kilogramı başına 50 mililitre olacak şekilde, PBS içinde hazırlanmış sıcak, %2 düşük jel noktasına sahip agar ile intratrakeal uygulama yapın; trakeayı bağlayın ve şişirilmiş akciğerleri 4 °C'deki bir PBS banyosunda 60 dakika boyunca soğutun. Agar, akciğer yapısını nazikçe stabilize etmek için hava boşluklarında jelleşecek ve sertleşecektir. Bu süre zarfında, bir ustura veya skalpel kullanarak, agar ile stabilize edilmiş fare akciğer dokusunu yaklaşık beşer milimetre uzunluk ve genişlikte ve 400 µm kalınlığında şeritler halinde kesin.

Ardından, büyük havayollarını ve damarları hariç tutmak için artık arosları temizlemek amacıyla şeritleri 37 °C'de beş dakika boyunca PBS ile yıkayın. Eğer havayolları veya büyük damarlar görüntülenecekse, ana bronşlere uzak subplevral bölgelerden şeritler kesin; FM mikro indentasyon için ilgi alanlarını izole etmek amacıyla ana bronşlere daha proksimal akciğer dokusundan şeritler kesin. Dokuyu faz kontrast mikroskopisi ile görüntüleyin veya immün boyama yapıp floresan mikroskopisi ile görüntüleyin.

Prosedür için lütfen bu protokolün yazılı kısmına bakınız. FM karakterizasyonundan hemen önce, yüzen dokunun altından lamı kaldırarak doku şeritlerini poly L lysine kaplı 15 milimetrelik lamellerle birleştirin ve doku şeridinin lamel yüzeyine eşit şekilde yayıldığından emin olun. Gerekirse, şeridi ikinci bir temiz kaplamasız lamel ile sandviç yapın ve dokunun poly L lysine kaplı lamele tutunmasına yardımcı olmak için hafif basınç uygulayın.

Her mikro girintileme deney serisinden hemen önce, AFM sistemini üretici talimatlarına uygun olarak kalibre edin. Bunun için iki kritik parametreyi belirleyin: havada termal dalgalanma yöntemi kullanılarak hesaplanan kano (cantilever) yay sabiti ve fotodiyot çıkış sinyalini gerçek kano sapma mesafesine ölçeklemek için kullanılan bir parametre olan kano sapma hassasiyeti.

Temiz bir cam lam üzerindeki PBS içerisinde standart bir zorlanmış yer değiştirme eğrisi elde ederek sapma hassasiyetini kalibre edin. Ardından, zorlanmış yer değiştirme eğrisi ölçümünde zorlanmış yer değiştirme eğrisinin eğimini hesaplayın. AFM ucu, tek bir noktada numune yüzeyine doğru ilerletilir ve yüzeyden geri çekilirken, konsolun sapması delta D, uç yer değiştirmesi delta Z'nin bir fonksiyonu olarak izlenir. FM probları kullanılarak, 0,06 newton/meter yay sabitine sahip, beş mikrometre çapında borosilikat küresel uca sahip bir silikon nitrür üçgen konsol kullanılması önerilir.

Kayma modülleri 100 ile 50.000 pascal arasında değişen yumuşak malzemelerin mekanik karakterizasyonunu gerçekleştirdik. Örnek lamının alt yüzeyini kağıt havluyla silin, ardından vakum gresi kullanarak standart bir cam lamı üzerine sabitleyin. Cam lamı AFM örnek tablasına yerleştirin ve dokunun üzerini 500 µL oda sıcaklığında PBS ile kapatın.

Ardından, FM tarama kafasını numunenin üzerine yerleştirin. A FM ucunu görüş alanının merkezine hizalamak için mikroskop numune tablasını okülerle görüntüleme yapacak şekilde ayarlayın. Doku üzerinde ilgi çekici bir alan seçmek için A FM numune tablasını hareket ettirin.

Ardından, dokunun faz kontrast görüntüsünü ve/veya istenilen floresan görüntülerini kaydetmek için CCD kamera görünümüne geçin. AFM ucunu, numune ile tam temas sağlayana kadar yavaşça aşağıya doğru hareket ettirin. Yumuşak numunelerin AFM mikro girinti karakterizasyonu, elastik modül hesaplamasında kullanılan Hertz modelini geçersiz kılan büyük lokal gerilmelerden kaçınmak için küçük girinti derinlikleri gerektirir; büyük gerilmeleri önlemek için, kantilever maksimum sapmasını 500 nanometers olarak ayarlayarak girintiyi tetikleme modunda gerçekleştirin.

Bu sapma sınırı, maksimum batırma kuvvetini 30 nano newton'un altında tutacaktır. Batırma hızı, yumuşak örneğin viskoelastik özelliklerinden ziyade elastik özelliklerini incelemek için yeterince yavaş seçilmelidir. İlgi alanındaki bir bölgeden tek bir ölçüm yapmak için, akciğer dokusu için saniyede iki ila 20 mikrometre arasında bir hız aralığı seçin.

AFM probunu ilgilenilen konuma getirin ve standart bir kuvvet-yer değiştirme eğrisi toplamak için tek bir girinti işlemi gerçekleştirin. Prob yalnızca Z yönünde hareket edecektir. Bir ilgi bölgesinin otomatik haritalaması için kuvvet haritası moduna geçin, tarama boyutunu ve seçilen alan içindeki örnekleme noktalarını belirleyin.

AFM ucu, indantasyon hareketleri arasında numune yüzeyi boyunca taranır ve önceden tanımlanmış bir numune ızgarası içindeki her noktada bireysel kuvvet-yer değiştirme eğrileri toplar. 80 mikrometre çarpı 80 mikrometrelik bir alanı, saniyede 20 mikrometre indantasyon hızıyla haritalamak için 16 çarpı 16'lık bir numune ızgarası kullanmanın pratik olduğunu gördük; bu işlem yaklaşık 10 dakikada tamamlanabilmektedir. Young modülünü hesaplamak için, burada F = K_C × ΔD'nin kantileveri bükmek için gereken kuvvet olduğu gösterildiği üzere, kuvvet-yer değiştirme eğrisini en küçük kareler doğrusal olmayan eğri uydurma yöntemini kullanarak Hertz küresel indantasyon modeline uydurun.

K sub C, konsol yay sabitidir. R, küre uç yarıçapıdır; delta, delta Z eksi delta D'ye eşit olan girme derinliğidir ve new, akciğer dokusu için 0,4'e eşit olan örneğin poisson oranıdır. Uyumun kalitesini değerlendirmek için, doğrusal olmayan eğri uydurma işlemi sırasında veriler ile uyum değerleri arasındaki farkın kareler toplamı olan SSR değerini hesaplayın.

Yüksek SSR değerlerine sahip hatalı eğrilerden gelen verileri atarak, güvenilmez veya yorumlanamaz ölçümleri eleyin. İstenirse, elastik modül (E), E eşittir iki kez (bir artı ν) çarpı G ilişkisi kullanılarak kayma modülüne (G) dönüştürülür. Kuvvet haritası modunda toplanan sertlik uzamsal desenlerini görselleştirmek için, örneğin 80 µm x 80 µm'lik bir alanı kapsayan 16 x 16'lık bir ızgarada modül verilerini ve kontur haritalarını çizin.

Büyük miktarda kuvvet eğrisi verisini işlemek için, kuvvet yer değiştirme eğrilerini otomatik olarak sığdırmak, modülleri çıkarmak ve/veya kontur haritaları veya ELA grafiği çizmek üzere özel bir algoritma yazılabilir. Az önce açıklanan prosedürler ve parametreler kullanılarak hazırlanan bu şekil, dokunun uygun şekilde kesildiğini ve boyandığını göstermektedir. Bazal membran bileşeni laminin için uygulanan, fikse etme veya permeasyon işlemi içermeyen immünofloresan boyama ile gözlemlendiği üzere, akciğer parankiminin alveoler mikro yapısı iyi korunmuştur.

Bu paneller; daha önce PBS ile tedavi edilmiş veya fibrozis indüklemek için bleomisin ile tedavi edilmiş farelerden alınan taze sabitlenmemiş akciğerlerdeki kolajen için immünofloresan boyamaları göstermektedir. Bir FM mikro girinti (mikro-indentasyon) yönteminden elde edilen örnek kuvvet-yer değiştirme grafikleri, aynı uygulanan kuvvet altında burada gösterilmiştir. Bir AFM ucu, yumuşak bir bölgede büyük bir girinti oluşturarak mavi ile gösterilen nispeten düz bir kuvvet-yer değiştirme eğrisi oluştururken; daha sert bir bölge için kırmızı ile gösterilen küçük bir girinti ve dik bir kuvvet-yer değiştirme eğrisi oluşturur.

Her bir girinti işleminden sonra temiz kuvvet eğrileri elde edebilmek için, A FM ucunun bir sonraki girintiden önce numune yüzeyinden tamamen geri çekilmesi ve temasın kesilmesi gerekir. Bu temassız durum, ucun konsol sapması olmaksızın hareket ettiği eğrinin düz bölgesine karşılık gelir. Bu şekil, ucun numune yüzeyinden tamamen geri çekilmediği durumlarda (örneğin yumuşak numunenin uca yapışması gibi) ortaya çıkan ve ucun yumuşak numuneye tamamen hapsolması durumunda temas noktasını belirlemeyi imkansız kılan, düz bölgesi olmayan tipik bir hatalı eğriyi göstermektedir.

Eğri, belirgin bir sapma olmadan, ancak düşük düzeyde gürültüyle bu şekilde görünebilir. Bu şekil sertliği göstermektedir. Zorlamalı yer değiştirme eğrilerinden elde edilen ve sertlik haritaları olarak mekansal olarak görüntülenen veriler (ELAs graft olarak adlandırılan), renklerin sertlikle ölçeklendiği ELAs graftlarda normal ve fibrotik akciğer parankimindeki doku sertliğinin kapsamı ve dağılımında çarpıcı farklar ile özellikle fibrotik akciğer örneği içerisinde sertlikte büyük mekansal varyasyonlar olduğunu göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, Atomik Kuvvet mikroskobu kullanarak taze akciğer dokusunun yerel elastik özelliklerini doğrudan ölçerek, akciğer parankiminin yerel mekanik ortamının nasıl karakterize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.