Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro

Protein testi. Protein etkileşimi, protein fonksiyonelliğinin çözümlenmesi için vazgeçilmezdir. Bu video, bir membran üzerindeki immobilize edilmiş protein ile çözünür bir protein arasındaki etkileşimi test etmek için kullanılan bir in vitro protein-protein bağlanma analizini tanıtmaktadır.

İlk olarak, füzyon proteinleri klonlanır, eksprese edilir ve ekstrakte edilir. Etiketli çözünmez protein nitroselüloz membrana immobilize edilir ve doğal konformasyonuna yeniden katlanması için işleme tabi tutulur. Ardından membran, etiketli çözünür proteinlerle probe edilir ve proteinlerin tespiti için immünoblotlama gerçekleştirilir.

Etiketli proteinler etkileşime girerse, membrandaki immobilize protein tarafından yakalanırlar ve immunoblotting kaynaklı sinyal gözlemlenir. Bu nedenle bu analiz, çözünmez bir protein ile çözeltideki bir protein arasındaki etkileşimi test etmek için güvenilir bir yöntem sunar. Bu tekniğin GST pull down gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çözünmez protein ile çözünür protein arasındaki bağlanmayı in vitro ortamda güvenilir bir şekilde değerlendirebilmenizdir.

Bu prosedürün ilk adımı, tespit için genetik olarak etiketlenmiş proteinler üretmektir. Membrana immobilize edilecek proteinin klonlanmasıyla başlayın. İfade vektörüne kodlanan GST gibi büyük bir etikete sahip, immobilize edilecek proteine pro Im olarak atıfta bulunun; sadece etiketi kodlayan boş ifade vektörü ise immobilize protein negatif kontrolü olarak kullanılacak ve pro IM nc olarak adlandırılacaktır.

Ardından, çözünür prob olarak kullanılacak proteini, strep two gibi farklı bir etiketin kodlandığı bir ekspresyon vektörüne klonlayın. Bu, çözünür protein için prosol olarak adlandırılacaktır; negatif kontrol olarak, negatif kontrolle bir çözünür proteini aynı ekspresyon vektörüne klonlayın. Bu, çözünür protein negatif kontrolü için Prosol NC olarak adlandırılacaktır.

Ardından, etiketli proteinleri eksprese etmek için E. coli veya baculovirüs gibi bir protein ekspresyon sistemi kullanın. Kullanılan ekspresyon sistemi, translasyon sonrası modifikasyon gereksinimlerine göre dikkatle seçilmelidir. Eksprese edilen proteinleri seçilen organizmadan ekstrakte edin. pro IM ve pro I mnc Resus için.

Hücreleri, proteaz inhibitör kokteyli içeren SDS page yükleme tamponunda süspande edin. Ardından hücreleri beş dakika boyunca kaynatın ve ardından çökelmeyi uzaklaştırmak için santrifüj ederek Prosol ve prosol NC'yi ekstrakte edin. Standart prosedürleri uygulayın. Proteinler nitrocellulose membrana immobilize edildikten sonra yeniden katlanacağı için pro IMS denatüre edici koşullar altında ekstrakte edilebilir.

Bununla birlikte, etiketli proteinler ekstre edildikten sonra bağlama tamponuna eklenecekleri için, doğal konformasyon sağlamak amacıyla prosol ekstrakte edilmelidir. Rekombinan proteinlerin konsantrasyonunu BioRad protein analiz kiti gibi standart bir yöntem kullanarak belirleyin. Analiz için saflaştırılmış protein yerine ham ekstrakt kullanılacaksa.

Kumasi ile boyanmış bir SDS poliakrilamid jel üzerindeki ilgili bandın tarama densitometrisi ile ilgilenilen proteinin konsantrasyonunu tahmin edin. Referans olarak BSA'nın bilinen konsantrasyonlarını kullanın. Ardından, BSA'nın tarama densitometrisi ile ölçülen sinyal yoğunluklarına dayanarak standart eğriyi çizin ve ham ekstrede bulunan protein miktarını hesaplayın.

Prosedürün bir sonraki adımı, pro Iam ve pro IAM NC'nin membrana immobilize edilmesidir. İşleme, pro Iam ve pro IAM NC ekstraktlarından birer mikrogramı, bir SDS poliakrilamid jele çift kopya halinde yükleyerek başlayın. Elektroforez sonrası jeli cam plakalardan çıkarıp 100 mililitre transfer tamponuna yerleştirin ve oda sıcaklığında, hafif ajitasyonla 20 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, proteinleri bir nitroselüloz membrana aktarmak için western blot uygulayın; aktarım sonrası membranla bağlanan proteinlerin yeniden katlanmasına izin verin. Membranı 15 milliliters tampon A içerisine yerleştirin ve hafif ajitasyonla inkübe edin. Kalan SDS'yi uzaklaştırmak için oda sıcaklığında, hafif ajitasyonla 15 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından membranı tampondan dikkatlice çıkarın. Daha sonra membranı 25 mililitre denatürasyon tamponuna yerleştirin. Oda sıcaklığında, hafif ajitasyonla iki saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyon sırasında nitrokselüloz membran opak hale gelecektir. Ardından, pens kullanarak membranı 25 mililitre TBS içerisine aktarın ve beş dakika boyunca hafif ajitasyonla inkübe edin. Bu adım sırasında membran orijinal beyaz rengine döner.

Ardından, membranı 25 mililitre bağlama tamponuna aktarın. Dört derece Celsius'ta, hafif ajitasyonla gece boyunca inkübe edin. Sonrasında, immobilize edilen proteini tespit etmek için membran üzerinde çözünür protein kullanılacaktır.

İlk olarak, hibridizasyon tamponlarını hazırlayın; 10 mililitre taze bağlama tamponu içeren ayrı tüplere birer 10 mikrogram prosol ve prosol NC seyrelterek ekleyin. Ardından tamponu bir hibridizasyon torbasına aktarın. Sonrasında, membranı her ikisi de pro IM ve pro IAM nc içeren iki şerit halinde kesin.

Bu membranlar hibridizasyon tamponuna yerleştirilecektir. Her bir membranı prosol veya prosol NC hibridizasyon çözeltisine aktarın ve oda sıcaklığında, hafif ajitasyonla 1,5 saat boyunca inkübe edin. Membranları hibridizasyon çözeltilerinden çıkarın ve TBS içerisinde 15 dakika boyunca üç kez yıkayın.

Protein-protein etkileşimlerini görüntülemek için, membranı TBST içerisindeki %2,5 yağsız süt ile bir saat boyunca bloke edin. İnkübasyonun ardından, bloke edilmiş membranları primer antikor çözeltisine yerleştirin. Bu aşamada anti-strep two poliklonal tavşan antikoru kullanılır.

İnkübasyonun ardından, oda sıcaklığında hafif ajitasyon ile bir saat boyunca inkübe edin. Membranları 20 mililitre TBST içinde 15 dakika boyunca ve ardından oda sıcaklığında hafif ajitasyon ile beşer dakikalık iki kez durulayın. Daha sonra membranları HRP konjuge ikincil antikor solüsyonuna yerleştirin; burada HRP'ye konjuge edilmiş bir anti-tavşan IgG antikoru kullanılır.

Oda sıcaklığında, hafif ajitasyonla bir saat boyunca inkübe edin. Membranları 20 mililitre TBST içerisinde 15 dakika ve ardından daha önce olduğu gibi oda sıcaklığında hafif ajitasyonla iki kez beşer dakika boyunca yıkayın. Son TBS yıkamasından sonra, bir HRP kemilüminesans substratı (Millipore, Molan Western Chemiluminescent) kullanarak protein-protein etkileşimini görselleştirin.

HRP substratı, prosolün immün blotlanmasından sonra kullanılır. Membranı TBST ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir kez ve beşer dakikalık iki kez durulayın. Ardından membranları, proya yönelik etiket için birincil antikor ile yeniden problayın.

Ardından uygun sekonder antikor uygulanır. Protein membran kaplama analizinde elde edilen bantların kimliğini doğrulamak için kemilüminesans saptaması ile PRO I ve pro Im NNC görselleştirilir. Protein A ve K ile YFP ve MP CYFP arasındaki etkileşim, burada gösterildiği gibi, bu videoda açıklanan yöntem kullanılarak tütün epidermal hücrelerinde değerlendirilmiştir.

Biyomoleküler floresan komplementasyonu değerlendirildiğinde, güçlü bir YFP sinyali yeniden oluşturulmuştur. Bu BFC sinyali, MP'nin oldukça çözünmez bir protein olması nedeniyle plazma membranının karakteristik özelliği olan hücre çeperindeki Punta bölgelerinde birikmiştir. Protein bakterilerde veya bitkilerde eksprese edildiğinde, bu etkileşimi doğrulamak için protein membran örtüm deneyi uygulanmıştır.

Bir mikrogram GST MP veya füzyonlanmamış GST içeren in vitro protein ekstraktları, SDS poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrıştırılmış ve ardından nitrocellulose membrana elektro transferi yapılmıştır. Bu proteinler çözünür a nnk strep iki ile problandığında, füzyonlanmamış GST'nin aksine GST mp bağlanma göstermiştir. Dahası, aynı protein seti ilgisiz bir pro saw nc IE Arabidopsis Sitoplazmik, NADH kinaz strep iki etiketli ile problandığında hiçbir bağlanma gözlemlenmemiş olup bu durum A NK MP etkileşiminin özgüllüğünü daha da kanıtlamıştır. Bu prosedürü uygularken, immobilize edilen proteinlerin sunulan protokole uygun olarak doğru şekilde yeniden doldurulduğunu hatırlamak önemlidir.