İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücreler transfekte ve Nucleofecting

Bu deneyin genel amacı, optimize edilmiş transfeksiyon ve nükleer etkileşim protokolleri kullanarak insan kaynaklı uyarılmış pluripotent kök hücrelerde yüksek transfeksiyon verimliliği elde etmektir. Bu, öncelikle insan kaynaklı uyarılmış pluripotent kök hücrelerin besleyici hücre içermeyen kültürlerinin oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Transfeksiyon için insan kaynaklı uyarılmış pluripotent kök hücreler gece boyunca gelt, TRX veya matrigel üzerine ekilir.

Nükleofeksiyonda, tripsin ile küçük hücre kümeleri elde edilir, plakalanmış hücrelere bir plazmid DNA ve gen transfer reaktifi karışımı eklenir ve ardından plak santrifüj edilerek 37 °C'de inkübe edilir. İnsan iPS hücre süspansiyonu, bir nükleofeksiyona cihazında nükleofekte edilir ve hücreler meth kondisyonlu medyuma yeniden süspanse edilerek 37 °C'de inkübe edilir. Sonuç olarak, insan iPS hücrelerinde yüksek transfeksiyona verimliliği aracılığıyla etkili genetik manipülasyonu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, daha önce açıklanan transfeksiyon elektroporasyonu ve nükleer affeksiyon yöntemleri gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, laboratuvarımızda tutarlı sonuçlarla insan IPS hücrelerinde yüksek transfeksiyon verimliliğinin rutin olarak elde edilebilmesidir. Protokollerimiz ayrıca genetik modifikasyon sonrası minimum hücre ölümünü sağlar. Bu nedenle, protokollerimiz transgenik insan IPS hücre hatlarının hızlı ve büyük ölçekte üretimine olanak tanır. İnsan uyarılmış pluripotent kök hücreleri besleyici hücre içermeyen kültürlere adapte etmeden önce, gelt TRX kaplı kapları hazırlayın.

Ardından, daha önce feeder hücreler üzerinde tutulan insan IPC'lerini kuyuk başına 1 mL Accutane ile masaj yaparak yıkayın ve hücrelerin çoğu ayrılmaya başlayana kadar 37 °C'de bir dakika boyunca inkübe edin; hücrelerin üzerine 10 ila 15 adet cam boncuk ekleyin ve plakayı nazikçe sallayın. Daha sonra 2 mL knockout D-M-E-M-F 12 ekleyin ve nazikçe triture edin. Hücre süspansiyonunu 10 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Hücreleri oda sıcaklığında, üç dakika boyunca 800 RPM hızında santrifüjleyin. İnsan IPSC peletine dokunmadan süpernatantı aspire edin. Hücre peletini nazikçe dağıtmak için tüpü hafifçe vurun.

Reese, insan iPSC peletini uygun hacimdeki STEM pro besiyerinde süspande ederek gel TRE kaplı bir plakanın kuyucuklarına dağıt. Proliferasyon hızına bağlı olarak, insan iPSC'ler bir e iki ile bir e altı arasındaki bölünme oranlarında pasajlanabilir. Plakayı dikkatlice %5 karbondioksit ve 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştir ve hücrelerin kuyucuklara eşit şekilde dağılmasını sağlamak için plakayı nazikçe salla.

Hücreleri her gün besleyin. Hücreler %80 yoğunluğa ulaştığında, yeni bir jele tekrar pasajlanmaya hazır hale gelirler. Optimal transfeksiyonda verimlilik elde etmek için, transfeksiyona giriş gününde bir ekiye iki hücre bölme oranıyla Rex kaplı kuyucuktaki hücreler yaklaşık %40 ila %50 yoğunlukta olmalı ve jel kaplı kuyucuğa eşit şekilde dağılmış küçük koloniler şeklinde bulunmalıdır.

Bu prosedüre başlamak için, steril 1,5 mililitrelik bir eppendorf tüpünde 100 µL nakavt ortamı hazırlayın. 27 µL gene juice transfeksiyon reaktifi ekleyin, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Ardından, 4 µg plazmid DNA ekleyin.

Plazmid seçimi, optimal transfeksiyon verimliliği için kritiktir. Burada kullanılan plazmid, insan IPC'lerinde transkripsiyonel olarak aktif güçlü bir promotör olan CAG promotörü tarafından yönetilen geliştirilmiş yeşil floresan proteine sahiptir. Tüpü 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.

15 dakika sonra, gen sıvısı DNA karışımını hücrelere ekleyin ve plakayı şişirin. Transfeksiyon karışımının kuyuktaki insan IPC'leri ile temasını artırmak için plağı 1.200 RPM'de beş dakika döndürün. Hücreleri 37 °C'de gece boyunca inkübe edin ve ertesi güne kadar bekletin.

Nükleer efektleme gününde transfeksiyon verimliliğini izleyin; insan IPC'lerini, insan IPSC'leri ön işlemden geçirilirken en az bir saat boyunca 37 °C'de 10 µM rock inhibitörü ile ön işlemden geçirin. Steril bir 1,5 mL Eppendorf tüpünde 82 µL insan kök hücre nükleer efektör çözeltisi hazırlayın. 80 µL ekleyin.

Ekleyin ve pipetleme yoluyla iyice karıştırın. Çözeltiyi 37 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin. Daha önceden hazırlanmış besleyici hücre koşullandırılmış ortamını ve %0,25 tripsin-EDTA'yı steril kabin altında 37 °C'ye ısıtın.

Bir adet steril 15 mililitrelik konik tüpü önceden etiketleyin. Çekirdek etkisine maruz bırakılacak insan IPSC kültüründeki medyumu dikkatlice uzaklaştırın ve hücreleri fosfat tamponlu salin ile nazikçe yıkayın. PBS'yi aspire edin ve tripsin ekleyerek hücreleri 37 derece Celsius'ta üç dakika inkübe edin.

Başarılı çekirdek etkileşimi için, hücrelerin tripsin ile tekil hücrelere ayrılmaması kritik öneme sahiptir. Bunun yerine, hücreler iki ila üç hücreden oluşan küçük kümeler halinde tritüre edilmelidir. Hücreleri, P 1000 pipet ucuyla hafifçe yeniden süspanse ederek iki ila üç hücreden oluşan küçük kümeler haline getirin.

Tüm insan IPC'lerinin tamamen ayrıldığından emin olmak için kuyucuğun dibini tekrarlayan pipetleme işlemiyle yıkayın. Ardından, hücre süspansiyonunu etiketlenmiş 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Sonra, dokuz mililitre fare embriyonik fibroblast medyumu ekleyin.

Tripsini inaktive etmek için hücreleri 800 RPM'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre peletine dokunmadan süpernatantı dikkatlice aspire edin. Hücreleri, önceden ısıtılmış 100 µL insan kök hücre nükleer efektör çözeltisi içinde süspanse edin.

Bir mililitrelik pipet ucu kullanarak hücreleri nükleer efektör tüpüne aktarın. Hücre süspansiyonuna dört mikrogram plazmid DNA ekleyin; hücreleri ve DNA'yı nazikçe çalkalayarak karıştırın. Tüpe çeker ocak yüzeyinde iki kez vurun.

Vete'yi, nükleer efektör cihazının nükleer efektör tutucusuna yerleştirin. x düğmesine basarak B 0 1 6 nükleer efekt hücreleri programını seçin; ekranda Okay görüntülenecektir. Genellikle bir ila beş saniye süren nükleer efekt işlemi tamamlandığında, nükleer efekt kitinde sağlanan plastik pasta pipetini kullanarak nükleer efektli hücreleri vete'den geri alın. Hücreleri, önceden ısıtılmış CM ve rock inhibitörü içeren steril 1,5 milliliter eend orph içerisinde resüspansiyon yaparak geri kazanın ve hücreleri 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.

10 dakika sonra, hücreleri damla damla besleyici tabakalara aktarmak için bir mililitrelik pipet ucu kullanın. Hücreleri ertesi güne kadar 37 °C'de gece boyu inkübe edin. Transfeksiyon verimliliğini izleyin.

Burada, plazmid DNA transfeksiyondan 12 saat sonra gene juice on gel Rex kullanılarak transfekte edilmiş, EGFP eksprese eden RIV one insan iPSC hücrelerinin fotomikrografları gösterilmektedir. Güçlü bir promotör ile gene juice kullanılarak yapılan insan iPSC'lerin DNA transfeksiyonu, geçici bir transfeksiyondan sonra genellikle EGFP raporcu eksprese eden hücrelerin %60'ından fazlasını sağlar.

EGFP eksprese eden hücreler, B 0 1 6 nükleer transfeksiyon programı veya A 0 2 3 nükleer transfeksiyon programı kullanılarak gerçekleştirilen nükleer transfeksiyonun ardından besleyici hücreler üzerine ekilen ve koloniler oluşturan RIV one insan IPC'lerinin bu görüntülerinde gösterildiği gibi, nükleer transfeksiyon yoluyla da elde edilebilir. B 0 1 6 programının kullanımı %80'e kadar EGFP pozitif hücre ile sonuçlanırken, A 0 2 3 programı %10'dan daha az EGFP pozitif hücre sağlamıştır. Ayrıca, trends genini eksprese eden transgenik insan iPSC'lerin stabil klonları türetilebilir.

Gene juice'den türetilen, yaygın EGFP ekspresyonuna sahip, stabil EGFP ekspresyonu gösteren insan iPSC kolonlarına bir örnek burada gösterilmiştir. Bu hücreler, embriyo gövdesi diferansiyasyonu sırasında konstitütif EGFP ekspresyonunu korurlar. Bu videoyu izledikten sonra, insan iPS hücrelerinin nasıl nukleokte edildiği ve transfekte edildiği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Verimli genetik manipülasyon, kök hücre biyolojisinin çeşitli yönlerini incelemek için temel bir araçtır ve insan iPS hücre hatlarının rejeneratif tıpta kullanımını hızlandıracaktır.