Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans

Bu prosedürün amacı, RNAi tabanlı bir genomik tarama ve floresan işaretli proteinler kullanarak C. elegans'ta protein ekspresyonu ve lokalizasyonunun embriyonik sonrası regülatörlerini belirlemektir. Uygun tarama suşu oluşturulduktan sonra, bir RNAi kütüphanesi seçilir. Prosedürün ilk adımı, kütüphane klonlarının bakterilere paketlenmesidir.

Ardından bakteriler seçilir, büyütülür ve belirli evrelerdeki C. elegans nematodlarına yedirilir. Nematodların 72 saat boyunca büyümesine izin verildikten sonra, ilgilenilen fenotipteki değişiklikler gözlemlenir. Son olarak, hedef proteinin ekspresyonundaki veya hücre altı lokalizasyonundaki değişimler floresan mikroskobu ile görselleştirilir.

Bu yöntem, floresan etiketli bir proteinin doğru hücre altı lokalizasyonu için gerekli olan genleri tanımlayabilir. Bununla birlikte, bu protokol ilgi duyulan diğer post-embriyonik fenotipleri etkileyen genlerin tanımlanması için modifiye edilebilir. Bu tekniğin mevcut yayınlanmış protokollere göre temel avantajı, çift zincirli RNA üretimini plaka işleminden önce bakterilerde indükleyerek hayvanlardaki RNAi yanıtının düzeyini ve tutarlılığını optimize etmiş olmamızdır.

Prosedürü, laboratuvarımdan araştırma görevlisi Kathy Fuss uygulamalı olarak gösterecektir. Deneye başladıktan sonraki iki ay içinde, önce klon kütüphanesini hazırlayın; seçilen besleme kütüphanesi klonlarının yanı sıra pozitif ve negatif kontrollerden alınan bakterileri LB karbonik tetrasiklin plaklarına ekimleyin. Pozitif kontrol olarak, BLE four gibi doz bağımlı post-embriyonik fenotip üreten bir gen içeren bir klon kullanın. Negatif kontrol için, boş bir vektör veya gözlemlenen fenotipi olmayan öngörülen bir psödogen içeren bir klon kullanın.

Plakaları gece boyunca inkübe edin; her klon için, ekim plakalarındaki tek bir koloniden 50 µg/mL karbonik asit içeren iki mL LB besiyerine inokülasyon yapın ve kültürleri gece boyunca ajitasyonla inkübe edin. Ertesi sabah çözeltiler bulanık olmalıdır; kültürlere IPTG ekleyerek çift zincirli RNA üretimini indükleyin ve aynı koşullar altında dört ila beş saat daha inkübe edin.

IPTG eklemek, yalnızca IPTG'ye ve NGM plağının yüzeyine güvenmekten daha tutarlı ve güçlü bir RNAi kaynaklı gen ürünü nakavdı sağlar. IPTG inkübasyonunun ardından, her klondan 30 µL kültür, hazırlanmış 24 kuyucuklu NGM RNAi plaklarının her bir kuyucuğuna damlatılır. Her kuyucuğa bir klon gelecek şekilde işlem yapılır. Her plakla iki kuyucuk kontrollere ayrılmalıdır.

Her bir kütüphanenin konumunu dikkatle işaretleyin. 24 kuyucuklu plakalara klonlama işlemini gerçekleştirin ve ardından plakaları kurumaları için yaklaşık 20 dakika boyunca steril bir laminar akış kabininde, kapakları açık şekilde bekletin. Agarın kenarlarının plakadan ayrılmasına izin vermeyin.

Evreleri belirlenmiş nematodlar plakalara kurutulduktan sonra, nematod hazırlama talimatları verilir. Bir sonraki bölümde, birinci larva evresindeki veya L1 nematodlardan oluşan evreleri belirlenmiş bir popülasyonla başlayın. L1 larvalarıyla başlamak, olası embriyonik letal fenotiplerin önüne geçer.

Taranacak hayvanların farklı gelişim aşamalarından oluşan bir popülasyona sahip olmak, görülen varyasyonların RNAi kaynaklı olduğu ve farklı aşamalarda meydana gelen normal varyasyonlar olmadığı konusundaki güveni artırır. Bununla birlikte, RNAi gelişimsel bir gecikmeye neden olursa, bu durum tarama yapan kişi tarafından not edilmelidir. Tarama suşunun farklı gelişim aşamalarını içeren karma bir popülasyonu. Çamaşır suyu.

Yalnızca yumurta kabuğuyla korunan embriyolar bu aşamadan sağ çıkacaktır; 20 °C'de gerçekleştirilirse hayvanlar 12 saat içinde, 16 °C'de gerçekleştirilirse ise bakteriyel kültürlerin inoküle edildiği gün 18 saat içinde ilgili evrelere gelecektir. Tarama suşunun bulunduğu, sağlıklı, hem gebe yetişkinlerin hem de embriyoların yer aldığı üç adet 100 mm'lik plaka seçin.

Tüm hayvanları steril M nine besiyeri ile yıkayın ve yıkama sıvısını vidalı kapaklı steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Yıkama sıvısı 3,5 mililitreden fazlaysa, hayvanları santrifüjleyin ve sıvının 3,5 mililitre dışındaki kısmını uzaklaştırın. 3,5 mililitreden az ise.

Embriyoları yetişkinlerden ayırmak için hacmi su veya M dokuz ile 3.5 mililitreye tamamlayın; her yıkamaya 1.5 mililitre sodyum hidroksit ve çamaşır suyu karışımı ekleyin. Hayvanların bu çözelti içinde 10 dakikadan fazla inkübe edilmesine izin vermeyin. Bir zamanlayıcıyı başlattıktan sonra, her tüpü 10 saniye boyunca vorteksleyin ve vorteksleme işlemini her iki dakikada bir tekrarlayın.

Her vorteksleme işleminden sonra, çözeltiyi hayvan leşleri açısından bir diseksiyon mikroskobu altında inceleyin. Altı ila sekiz dakika içinde, yetişkinler parçalanacak ve embriyolar serbest kalacaktır. Embriyoları, pellet haline getirerek ve pellet'i bozmadan süpernatantın mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırarak çamaşır suyu çözeltisinden ayırın.

Ardından, steril M nine ekleyip ajitasyon uygulayarak peleti 10 mililitre hacimde yeniden süspande edin. Çamaşır suyu kokusu tamamen yok olana kadar bu yıkama işlemini en az bir kez daha tekrarlayın. Hayvanların evrelerini daha sıkı şekilde belirlemek için, embriyoları besin içermeyen M nine ortamında çatlatarak L1 evresinde durdurun.

Bu işlem, M dokuz içindeki embriyoların küçük bir erlenmeyer flaskına aktarılmasıyla gerçekleştirilir. Flaskı, suş ve deney için uygun sıcaklıkta gece boyunca çalkalayın. Bu süre zarfında hayvanların tamamı yumurtadan çıkacak ve ertesi gün L bir diyapoz evresinde duraklayacaktır.

Hazırlanan çift zincirli RN eksprese eden bakterilere transfer ederek larvaların gelişimini belirlenen bir zaman noktasından itibaren yeniden başlatın. Bu işlem, 24 kuyucuklu plakaların bakterilerle damlatıldığı günle aynıdır. L1 hayvanlarını 15 ml'lik bir tüpe transfer ederek ve çöktürerek başlayın. Ardından hayvanları yarım ila 1 ml M9 içerisinde yoğunlaştırın ve yoğunlaştırılmış nematodlardan 5 µl'yi bir plakaya yerleştirin.

Plakadaki hayvanların sayısını sayın ve konsantre nematod çözeltisini ayarlayın. Her üç ila 10 µL için 30 solucan olacak şekilde ayarlayın. Son olarak, hazırlanan her bir kuyucuktaki bakterilerin üzerine yaklaşık 30 L tek evreli hayvan damlatın.

24 kuyucuklu plakada kuyucuk başına 30'dan fazla hayvan bulunması açlığa yol açabilir. Birkaç dakika sürecek olan lekelerin kuruması işleminin ardından, kapağı lastikle sabitleyin; hayvanları istenilen evrede değerlendirebilmek için gerekli sıcaklık ve sürede ters çevrilmiş şekilde inkübe edin. Nematodlar taramaya hazır olduğunda, pozitif ve negatif kontrollerin beklenen fenotipleri oluşturduğunu doğrulayın. Ardından, deneysel hayvanları gelişimsel anomaliler açısından gözlemleyin.

Ardından, bir diseksiyon mikroskobu kullanarak her kuyucuktan sekiz ila 12 hayvanı, beş mikrolitre anestezi damlası ile %4'lük Agri PET lamlarına yerleştirin. Uygun lamel kapatıldıktan sonra, bileşik mikroskopi kullanarak en az beş hayvanı gözlemleyin. Gen, gözlemlenen hayvan sayısı ve fenotipik sonuçları içeren düzenli bir veri tabanı tutun.

Her RNAi deneyi için, ortaya çıkan herhangi bir RNAi fenotipini mümkünse başka bir ikincil fenotip ile ve deneyi tekrarlayarak doğrulayın; tekrarlanan deneylerde aynı çizgi ekimden alınan bakteriler kullanılabilir. Eski çizgi ekimler, gece boyunca bekletilen sıvı kültürlerde zayıf büyümeye neden olabilir ve bu nedenle önce yeniden çizgi ekim yapılmalıdır. Bazı bakteri kültürleri, plazmitlerinde eksprese edilen gen ürünü nedeniyle iyi büyümeyebilir.

Bu durumda, ekim yapmadan önce bakterileri basitçe konsantre edin. Devam eden bir tarama için, evreleme amacıyla her zaman yeterli miktarda embriyonun hazır bulundurulması önemlidir. Tarama suşu her zaman beslenmeli, aç bırakılmamalı ve ilgilenilen fenotipi etkileyebilecek kontaminasyonlardan arındırılmış olmalıdır.

Hayvanların beslenmesi için bir bakım çizelgesi oluşturduk. DBL one lokalizasyonunu etkileyen genler, bu tarama için tasarlanmış bir suş kullanılarak RNAi ile belirlendi. GFP etiketli dbl one'ın normal ekspresyonu ventral sinir kordonu hücre gövdelerini içerir; DBL'ye karşı antisense RA ile beslenen hayvanlarda ise bir dizi punktum görülür.

Bir mRNA, DBL one ekspresyonunun ciddi şekilde azaldığını göstermiştir. Bu hayvanlar da fonksiyonel DBL L one eksikliği olan hayvanlar gibi küçüktü. RNA I taraması, ürünleri DBL one lokalizasyonunu etkileyen birçok başka geni başarıyla tanımlayarak TGF beta'nın hücresel düzeyde nasıl taşındığına dair anlayışımızı genişletmiş ve daha birçok araştırma için bir başlangıç noktası sağlamıştır.

Bu yöntem kullanılarak, tek bir kişi her hafta makul bir şekilde iki ila dört deney setini hazırlayabilir ve gözlemleyebilir. Örneğin, Pazartesi ve Salı günleri hazırlanan hayvanlar sırasıyla Perşembe ve Cuma günleri gözlemlenebilir ve ardından Pazartesi ile Salı günleri için Cuma ve Cumartesi günleri yeniden hayvan hazırlığı yapılabilir. Tarama süreciniz boyunca bu prosedürü izleyerek gözlemleri gerçekleştirin.

Evreleme için yeterli sayıda embriyoyu hazır bulundurmak önemlidir, bu nedenle tarama hattını düzenli olarak sürdürün. Ayrıca, tüm gözlemler hakkında ayrıntılı notlar almak önemlidir.