Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray

Bu video makalesi, kimyasal olarak bloke edilmiş bir antikor mikroarray'i kullanarak bir hepatosellüler karsinom hastasının serum örneğindeki 20 farklı glikoproteinin glikozilasyon profillerinin elde edilme prosedürünü açıklamaktadır. İlk olarak, glikoproteine özgü antikorlar doğrudan mikroarray lamlarına basılır ve lektin bağlanmasını önlemek için antikor glikanları bloke edilir. Hasta serum örnekleri uygulandığında, örnekteki glikoproteinler antikorlar tarafından yakalanır. Ardından, glikanları tespit etmek için biyotinize glikan bağlayıcı proteinler eklenir ve biyotinize lektinleri işaretlemek için di-konjuge neu travain eklenir.

Ardından, elde edilen verilerin floresan analizini tespit etmek için mikro array lamı taranır ve bu analiz, örnek proteinlerinin glikozilasyon profillerini ortaya çıkarır. Bu tekniğin, HPLC gibi mevcut yöntemlere göre birkaç avantajı vardır. Bu yöntem, tekil glikoproteinlerin doğal durumlarında tespit edilmesine olanak tanır.

Birden fazla proteindeki glikozilasyon değişikliğini eş zamanlı olarak taramak daha hızlı ve kolaydır. Hastalıkların, özellikle de en dikkatli incelediğimiz kanser ve karaciğer kanserinin biyobelirteçlerinin sıklıkla glikozile olduğunu saptadık. Spesifik glikoformları tespit edebilme yeteneğinin, biyobelirteçlerin performansını duyarlılık ve özgüllük açısından büyük ölçüde artırdığını gördük.

Böylece bu ölçüm, HCC'deki birden fazla serum proteini üzerindeki glikozilasyon değişikliklerine dair içgörüler sağlayabilir. Ayrıca pankreas kanseri, diyabet ve Alzheimer hastalığı gibi diğer kanserlerin ve hastalıkların patoloji çalışmaları ile biyobelirteç keşiflerinde de uygulanabilir. Prosedürü, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Chen Lu gösterecek.

Bu protokole önce antikor mikrodizisini hazırlayarak başlayın; mikrocentrifüj tüpleri içinde buz üzerinde, mikrodizi basımında kullanılacak tüm antikorları en az 40 mL PBS içerisinde 0,5 mg/mL konsantrasyona seyreltin; burada 26 farklı antikor pozitif kontrol olarak kullanılacaktır. Ayrıca PBS içinde aynı miktarda 0,5 mg/mL biotinillenmiş BSA hazırlayın. Her bir antikordan 40 mL'yi buz üzerindeki 384 kuyucuklu kaynak plakasına paylaştırmak için bir pipet kullanın.

Ardından, mikroarray kontrol yazılımında her bir antikor konumunu belirleyin. Sonra, plakayı kaynak olarak mikroarray cihazına yükleyin. Daha sonra 20 adet patoloji mikroarray lamını hedef olarak mikroarray cihazına yükleyin.

Mikrodiziyi, 27 antikorun ve kontrol proteininin dokuz dokuzluk bir düzende üçer kez noktalandığı 48 özdeş alt dizi basacak şekilde ayarlayın. Antikor mikrodizi lamlarını basmak için mikrodiziyi başlatın. Antikor mikrodizi lamlarını toplayın ve kurutucu içeren bir lam kasetinde saklayın.

Saklama sırasında protein denatürasyonunu ve lamlar üzerinde nem oluşumunu önlemek için kaseti plastik bir torba ile mühürleyin. Mühürlenmiş mikroarray lamlarını kullanana kadar dört derece Celsius sıcaklıkta saklayın. Bu prosedürün en zor ve en önemli tek aşaması kimyasal bloklama adımıdır.

Başarıyı sağlamak için, mikro dizi üzerine yeterli miktarda antikor basılması kritik önem taşımaktadır. Sodyum IDE ve agro asit hidrositi her zaman deneyden hemen önce taze olarak hazırlayın. Ayrıca, oksidasyon prosedürünü ışık görmeyecek şekilde 4 °C'de gerçekleştirdiğinizden emin olun.

Mikrodizilim lamlarını buzdolabından çıkarın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığına gelene kadar bekletin. Saklama kutusundan bir lam çıkarın. Lamı, %0.1 tween 20 içeren PBS bulunan bir yıkama kabına kısa süreliğine daldırın.

Ardından lamı, %0,1 tween içeren 15 millimolar sodyum asetat tamponuna 10 dakika boyunca daldırın. Sonra, 15 millimolar sodyum asetat tamponu içerisinde taze 150 millimolar sodyum periodat hazırlayın ve bunu bir lam yıkama havuzuna aktarın. Kullanıma kadar ışığan sakınarak buzdolabında muhafaza edin. Lamı sodyum asetat tamponundan çıkarın ve antikor tarafı yukarı bakacak şekilde taze sodyum periodat içeren havuza yerleştirin.

Işıktan korumak için havuzu alüminyum folyo ile kapatın. Ardından, lam havuzunu dört °C'de, hafif çalkalama ile iki saat boyunca bekletin. Lamı havuzdan çıkarın ve sodyum asetat tamponu ile üç kez beşer dakika boyunca kısaca durulayın.

Slaytı, bir inkübasyon odasında, oda sıcaklığında, hafifçe çalkalayarak 300 mililitre taze hazırlanmış 10 millimolar hidro glutamik asit bloklama çözeltisi içinde iki saat boyunca inkübe edin. Slaytları odadan çıkarın ve %0,1 tween içeren PBS ile üç dakika boyunca yıkayın. Ardından, bir slayt yıkama havuzunda, mikroarray slaytını oda sıcaklığında, hafifçe çalkalayarak 300 mililitre %0,5 tween içeren PBS içinde %1BSA çözeltisinde bir saat boyunca inkübe edin.

Lamları %0,1 tween içeren PBS ile üçer dakika boyunca üç kez durulayın. Mikroarray lamını kurutmak için lamı bir lam rafına yerleştirin ve ardından 1.200 ×g hızda iki dakika boyunca santrifüjleyin. Her bir alt diziyi ayırmak için lama bir balmumu ızgara baskısı uygulanmıştır.

Balmuma baskı makinesi 70 °C'de beş dakika boyunca ön ısıtıldıktan sonra, bloklanmış mikroarray lamı, antikor tarafı balmumuna bakacak şekilde makineye yerleştirin. Balmumu lam üzerine eşit şekilde basılana kadar kolu nazikçe çekin. Bu yöntem, tek bir örnek için gliko profilleme analizleri gerçekleştirmek veya birden fazla örnekte tek bir gliko epitopu ölçmek için kullanılabilir.

Burada gliko profilleme analizlerini göstereceğiz. 40 µL serumu; %0,1 tween 20, %0,1 bridge 35 ve her birinden 100 µg/mL fare, sıçan, tavşan, keçi ve eşek IgG içeren 360 µL PBS içinde seyrelterek başlayın. Bu hacim, her bir alt diziye altı µL seyreltilmiş serum solüsyonu uygulamak için yeterlidir.

Seyreltilmiş örnekten veya kontrolden altı mikrolitreyi slayttaki her bir alt diziye dikkatlice uygulayın. Slaytı, ıslak kağıt havlular içeren nemlendirilmiş bir kaset içerisinde oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Slaytı %0,1 tween içeren PBS ile üç dakika boyunca üç kez durulayın.

Ardından lamı 1200 ×g'de iki dakika santrifüj ederek kurutun. Buz üzerinde, 0,8 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, PBS tween içerisinde 10 mg/mL konsantrasyonda 20 µL biyotinize glikan bağlayan protein hazırlayın. Lamın her bir alt dizisine altı µL seyreltilmiş biyotinize lektin uygulayın ve ıslak kağıt havlularla nemlendirilmiş lam kutusunda, oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Slaytlar daha önce yapıldığı gibi %0,1 tween içeren PBS ile üç kez durulandıktan sonra, bir santrifüjde iki dakika boyunca 1200 ×g hızda döndürülerek kurutun. Buz üzerinde, 0,8 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, %0,1 tween içeren PBS içerisinde 10 mg/mL DITE 5 49 işaretli neut travain'den 400 µL hazırlayın. Her bir alt diziye altı µL DITE 5 49 işaretli neut travain uygulamak için tekrarlayıcı pipet kullanın ve inkübasyonu takiben slaytı nemlendirilmiş slayt kasetinde oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Lamı, %0,1 tween içeren PBS ile üç dakika boyunca üç kez durulayın. Lamı, bir santrifüjde 1200 ×g hızda iki dakika döndürerek kurutun. Lamı, floresan mikroarray tarayıcı kullanarak 10 mm çözünürlükte tarayın.

Lazer ve PMT ayarları, doygunluk gözlemlenmediğinden emin olunarak mümkün olduğunca yüksek tutulmalıdır. Görüntüyü array Pro 3.2 ile açın. Array şablonunu, antikor spot konumlarını gösteren array haritasına göre ayarlayın.

Her bir şablon daireyi görüntüdeki karşılık gelen leke üzerine dikkatlice hizalayın ve daha sonraki analizler için her bir lekenin yoğunluğunu bir Excel dosyasına çıkarın. Bloklama prosedürünün önemini incelemek için, 20 serum glikoproteini ve biyotine karşı 26 antikor içeren 48 özdeş alt diziden oluşan bir antikor mikro dizisi BSA, bu videoda açıklandığı şekilde tasarlanmış ve üretilmiştir.

Glikoprotein profilleme analizinde, iki özdeş mikroarray lamı oluşturulmuştur. Bunlardan biri kimyasal olarak bloklanmamış, diğeri ise bloklanmıştır; kontrol örneği birinci ve üçüncü sütunlardaki subar array'lere, havuzlanmış HCC serum örneği ise ikinci ve dördüncü sütunlardaki subar array'lere uygulanmıştır.

Ardından, farklı glikanlara özgü biyotinillenmiş lektinler, alt dizilerin bu görüntülerinde gösterildiği gibi her bir alt diziye uygulandı. Lektinler, kontrol sütunlarındaki yakalama antikorlarına bağlanarak, bloke edilmemiş mikrodizilerdeki serum yüklü sütunlardan ayırt edilemeyen yüksek bir arka plan oluşturdu. Ancak, aynı deney kimyasal olarak bloke edilmiş bir antikor mikro dizi lamı üzerinde gerçekleştirildiğinde, kontrol sütunlarındaki yakalama antikorlarına bağlanma görülmedi veya çok düşük düzeyde gerçekleşti; serum yüklü sütunlarda ise yüksek antijen bağlanması gözlendi.

Bu sonuçlar, kimyasal bloklama işleminin, antikorla yakalanan glikoproteinlerdeki glikanların ölçümü için kritik bir adım olduğunu göstermektedir. Protokol takip edildiğinde, HCC serumundaki 22 glikoproteinin glikozilasyon profilleri elde edilebilir. Bu teknik, doğru şekilde uygulandığında sekiz saat içinde tamamlanabilir. Antikorlar, modifiye edildiklerinde antijenlerine olan afinitelerini ve diğer özelliklerini kaybedebilirler.

Bu nedenle, bunu akılda tutmak ve bu prosedürü izlerken farklı kaynaklardan elde edilmiş birkaç farklı antikor kullanmak önemlidir. Glikozilasyon değişikliğinin protein ekspresyon seviyelerindeki değişime mi bağlı olduğu yoksa yalnızca her bir bireysel proteindeki glikozilasyon değişikliğinden mi kaynaklandığı gibi ek soruları yanıtlamak için, aynı mikroarray lamı kullanılarak her bir protein konsantrasyonunun belirlenmesi gibi diğer önlemler uygulanabilir. Patojen içeren serum örnekleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken koruyucu eldivenler gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.