Asma Bırak Yöntemiyle Fare Embriyonik Kök (MES) Hücreler in vitro Farklılaşma

Kök hücreler, vücuttaki birçok farklı hücre tipine dönüşebilme konusunda dikkat çekici bir potansiyele sahiptir. Vücut için bir tür onarım sistemi görevi görürler. Teorik olarak, diğer hücreleri yenilemek için sınırsız bir şekilde bölünebilirler.

Bir kök hücre bölündüğünde, her yeni hücre ya bir kök hücre olarak kalma ya da daha özelleşmiş bir işleve sahip başka bir hücre tipine dönüşme potansiyeline sahiptir. Bilimin bu gelecek vadeden alanı, bilim insanlarını hastalıkları in vitro tedavi etmek için hücre tabanlı tedavilerin olasılığını araştırmaya yöneltmektedir. Embriyonik kök hücrelerin farklılaşması, hücrelerin süspansiyon kültüründe kümelenmelerine izin verildiğinde gerçekleşir.

Fare embriyonik fibroblast besleyici hücreler ve lösemi inhibitör faktörü yokluğunda, bu hücre agregatlarına embriyo gövdeleri denir. Asılı damla yöntemi, kök hücrelerin in vitro ortamda embriyo gövdelerine farklılaşması için etkili bir prosedürdür. Merhaba, ben Stanford Üniversitesi Kardiyovasküler Tıp Bölümü'nden Sha Juan.

Bugün sizlere, el damlatma yöntemini kullanarak embriyonik kök hücrelerin embriyoid cisimciklere bireysel farklılaşması için uygulanan bir prosedürü göstereceğiz. Bu yöntemi genellikle embriyonik kök hücreleri kardiyomiyositlere farklılaştırmak için kullanırız. Bu prosedür; embriyonik kök hücrelerden tek hücre süspansiyonu hazırlama, el damlatma kültürleri oluşturma, el damlatma kültürlerini ultra düşük yapışmalı plakalara aktarma ve embriyoid cisimcikleri jelatin kaplı plakalara ekme adımlarını içermektedir.

Tamam, başlayalım. Prosedürün ilk adımı, embriyonik kök hücrelerden tek hücre süspansiyonu hazırlamaktır. Diferansiye olmamış embriyonik kök hücrelerimizi fare embriyonik fibroblastları üzerinde büyüterek kültüre ettiğimiz için, hücreleri ayırmalı ve fibroblastlardan uzaklaştırmalıyız.

Bunu yapmak için, hücreleri standart prosedürleri kullanarak tripsinize ederiz. Tripsin işlemi tamamlandığında, tripsini nötralize etmek için fare embriyonik kök hücre besiyeri ekleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın.

Ardından, görünür herhangi bir kümelenme olmadan ince bir hücre süspansiyonu elde edene kadar, tüpün dibine karşı pipetleyerek hücre kolonilerini parçalayın. Şimdi hücreleri beş dakika boyunca 1000 RPM hızda santrifüj edin. Santrifüj işleminden sonra süpernatanı aspire edin ve hücreleri 10 mL mouse ES hücre besiyeri ile yeniden süspanse edin.

Hücre süspansiyonunu %0,1 jelatin ile önceden kaplanmış bir T 75 flaska aktarın ve 37 °C sıcaklıkta, %5 CO2 ortamında bir saat boyunca inkübe edin. Bir saat sonra, fibroblastlar plağa tutunmuş olacak ancak kök hücreler medyumda kalacaktır. Kök hücreleri toplamak için medyumu pipetle çekin.

Hücreleri 1000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve ortamı aspire ederek uzaklaştırın. Ardından 10 mL daha diferansiyasyon medyumu ekleyin ve hücrelerin ince bir süspansiyon oluşturduğu görülene kadar tekrarlayan pipetleme ile hücreleri yeniden süspande edin. Hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın.

Şimdi, asılı damla yöntemini kullanarak hücre süspansiyonunu kültüre etmeye hazırız. Asılı damla kültürüne başlamak için, kök hücre süspansiyonunu 20 mikrolitrede 500 hücre konsantrasyonuna getirmek amacıyla farklılaşma medyumu ile seyreltin. Ardından, 150 milimetrelik bir doku kültürü plak kapağını ters çevirin.

Ardından, hücre süspansiyonunun 20 µL'sini plaka kapağının iç yüzeyine pipetleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak plakanın üzerine 10 mL PBS ekleyin. Plaka kapağını hızla ters çevirin ve asılı damlacıkları oluşturmak için nazikçe plakanın üzerine yerleştirin.

Plaka kapağı kapatıldıktan sonra, plakayı dikkatlice inkübatör kültürüne aktarın. Hücreleri iki gün boyunca rahatsız etmeyin. İnkübasyon tamamlandığında, asılı damla kültürünü ultra düşük yapışmalı plakalara aktarma işlemine geçeceğiz.

İki gün sonra, plaka kapağını dikkatlice ters çevirin, ardından 180 µL taze farklılaşma ortamı aspire edin ve birkaç damlayı 96 kuyucuklu ultra düşük yapışma özelliğine sahip bir plakaya damlatın. Daha sonra damlaları bir pipet yardımıyla alın ve tek tek 96 kuyucuklu plakaya aktarın. Plakaları üç gün boyunca rahatsız edilmeden inkübatöre yerleştirin.

Embriyo gövdeleri küre şeklinde büyümeye devam edecektir. İnkübasyon tamamlandığında, embriyo gövdelerini ekmeye hazır olacağız. Bu işlem, embriyo gövdelerinin farklılaşmaya devam etmesine yardımcı olmak amacıyla yapılacaktır.

Bunları 48 kuyucuklu jelatin kaplı bir plakaya aktarıyoruz. Bunu yapmak için, önce plakanın her kuyucuğunu 300 µL %0,1 jelatin ile kaplıyoruz. Jelatini ekledikten sonra, plakayı 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, 48 kuyucuklu plakadaki jelatini aspire edin. Ardından her birine 300 µL diferansiyasyon medyumu ekleyin. Şimdi embriyo gövdelerini 96 kuyucuklu plakadan, jelatin kaplı 48 kuyucuklu plakalara tek tek aktarın.

Hücreleri sürdürmek için genellikle ertesi gün ve ardından gün aşırı olarak besiyerini değiştiririz. Embriyonik kök hücrelerin farklılaşması için daha iyi protokoller aramak amacıyla bu yöntemi kullanıyoruz. Kardiyomiyositler kısmında, asılı damla kültürleri kullanarak fare embriyonik kök hücrelerinin in vitro farklılaştırmasının nasıl gerçekleştirileceğini size göstermiş olduk.

Bu yöntem etkilidir çünkü asılı damlanın yuvarlak tabanı embriyonik kök hücrelerin agregasyonuna izin verir ve böylece Embriyo cisimciklerinin oluşumu için uygun bir ortam sağlar. Bu prosedürü uygularken, asılı damlada agrege olan embriyonik kök hücre sayısının, başlangıçtaki hücre süspansiyonundaki hücre sayısı değiştirilerek kontrol edilebileceğini unutmamak önemlidir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler. Deneyinizde başarılar dileriz.