Bir Multititre Plaka Biçimi İnsan Pluripotent Kök Hücreler Nöron Hızlı ve Verimli Üretim

Aşağıdaki deneyin genel amacı, insan pluripotent kök hücrelerini veya H PSC'leri çoklu titrasyon plak formatı kullanarak nöronlara farklılaştırmaktır. Bu işlem, H PSC'lerden oluşan tek hücre süspansiyonunun hasat edilip gece boyunca embriyo gövdeleri veya EB'ler oluşturmak üzere V tabanlı 96 kuyucuklu plakalara ekilmesiyle gerçekleştirilir.

Ardından, nöroektoderm oluşumunu başlatmak için diferansiyasyon ortamı içeren U şekilli ultra düşük yapışmalı plakalara EBS'ler aktarılır. Sonrasında, nöronların dışa büyümesini teşvik etmek amacıyla EBS'ler matrigel kaplı kaplara ekilir. İmmünofloresan yöntemle, sekizinci gün civarında tipik nöronal belirteçlerin varlığını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

İnsan pluripotent kök hücrelerini nöronlara farklılaştırmak için kullanılan boyama protokolleri genellikle karmaşık ve zahmetlidir. Tesadüfen, insan pluripotent kök hücrelerinden nöronlar elde etmek için çok basit bir prosedür keşfettik.

Teknik açıdan, bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı; uygulanmasının kolay, hızlı ve maliyet açısından verimli olmasıdır. Aynı zamanda, prosedür laboratuvardan Dr MI Z tarafından sunulacaktır. Yazılı protokolde belirtildiği şekilde EB oluşum ortamını ve farklılaşma ortamını hazırlayın.

hPSC'leri, matrigel kaplı plaklarda mCCS (meth kondisyonlu ortam) gibi besleyici hücresiz koşullarda veya sub-konfluen aktif büyüme koşulları altında kimyasal olarak tanımlanmış kültür sistemleri kullanarak büyütün. Steril plastik pipet ucu ve stereo mikroskop yardımıyla, kendiliğinden farklılaşmış kolonileri mekanik olarak uzaklaştırın. Geriye kalan farklılaşmamış kolonileri PBS ile yıkayın ve tek hücrelere ayırmak için bir x rock inhibitörü içeren Accutane kullanın.

Tek hücreleri 200 G'de iki dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün ve küçük bir hacim EB oluşum ortamında yeniden süspande edin. Hücre titresini belirlemek için hemositometre kullanın. Mililitre başına 40.000 ile 80.000 hücre arasında bir titreye ulaşmak için kalan EB oluşum ortamına ek hücreler ekleyin.

Çok kanallı bir pipet kullanarak, kuyu başına 4.000 ila 8.000 hücre düşecek şekilde, 96'lı V tabanlı bir plakadaki her kuyucuğa 100 µL aktarın. Tüm hücreleri kuyucukların tabanında toplamak için plakayı, salınımlı bir plaka santrifüjünde 400 ×g hızda bir dakika boyunca döndürün. Hücreleri bir inkübatöre aktarın ve EBS'nin gece boyunca oluşmasını sağlayın; ertesi gün stereo mikroskop altında kontrol edin.

EBS'leri toplayın ve küçük bir hacim içinde, iki mililitre diferansiyasyon medyumu içeren 3,5 santimetrelik bir bakteri plağına aktarın. Plağı nazikçe döndürerek hücreleri yıkayın. Ultra düşük tutunma özelliğine sahip bir tabağın her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre diferansiyasyon medyumu ekleyin.

Stereo mikroskop altında alt 96 kuyucuklu plaka. EBS'yi yıkama kabından 96 U kuyucuklarına küçük hacimlerde aktarın. Dördüncü günde nöroektoderm oluşumuna izin vermek için EBS'yi dört gün boyunca inkübe edin.

Hücreleri farklılaşma medyumu ile yıkayın ve 12 kuyucuklu plaka gibi matrigel kaplı bir çoklu titrasyon plakası kuyucuklarına tek tek ekleyin. Nöronların rahatça büyümesini sağlamak için hücreler kuyucuklar içinde eşit şekilde dağıtılmalıdır. EBS'nin oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika boyunca matrigele gevşekçe tutunmasını sağlayın.

Ardından plakayı dikkatlice inkübatöre aktarın. Nöronlar, önümüzdeki dört gün boyunca plakaya ekilen EBS'den radyal bir şekilde büyüyecektir. Daha önce, birçok diğer çalışma ile uyumlu olarak, H PSC'lerden elde edilen EBS'lerin, H HPC'lerin düşük yapışma özelliğine sahip kaplara rutin bölünmesiyle oluşan agregatların basitçe yeniden ekilmesiyle oluşturulabileceğini göstermiştik.

Bu durum genellikle hücre boyutlarının geniş bir dağılım göstermesiyle sonuçlanır. Bir diğer sorun ise, süspansiyonda tutulan EB'lerin birbirleriyle agregasyon eğiliminde olması ve bunun da boyut heterojenliğinin daha da artmasına yol açmasıdır; bunu önlemek için tek hücreli hPSC'ler düşük tutunma özellikli kuyucuklara ekilmiş, ancak bu durum EB oluşumunun gerçekleşmemesine ve hücre ölümüne yol açmıştır. Bununla birlikte, hücre sağkalım molekülü Y 2 7 6 3 2'nin, hESC'lerden EB oluşumunu artırdığı gösterilen polivinil alkol ile kombine edilmesi, tek hücreli hESC süspansiyonlarından geceden sabaha EB oluşmasını sağlamıştır.

Bu çoklu titre plak formatında, kuyu başına farklı sayıda hücre yerleştirerek EB boyutları kolaylıkla sıkı bir şekilde kontrol edilebilmektedir. Geleneksel tekniklerin kullanımının aksine, EB'ler ultra düşük tutunumlu 96'lı U plaklara aktarıldıktan sonra, nöroektoderm oluşumu F-G-F-E-R-K-T-G, TGF beta SMA iki ve BP SMA bir inhibitörlerinden oluşan küçük bir molekül kokteyli kullanılarak indüklenmiş ve ardından hücrelerin nöronlar oluşturması için matrigel üzerine ekilmesine olanak sağlanmıştır. EB oluşumunun yaklaşık 8.000 hücreden başlatılması, ekilen EB'lerden belirgin nöronal uzantıların çıkmasıyla karakterize edilen en iyi nöronal farklılaşma kapasitesini sağlamıştır.

Ek platelets sonrası azalmış nekrotik EB merkezleri ile B rrn three A ve beta three tubulin gibi duyusal ve pan nöronal belirteçlerin yüksek ekspresyonu gözlemlenmiştir. Genel nöronal farklılaşma verimlilikleri, şimdiye kadar hem HSC'ler hem de HI PSC'ler için uygulanabilir olan orijinal prosedürle karşılaştırılabilir görünmektedir. Üç bağımsız HPSC hattı, HES ve HIPS hücreleri çok kuyucuklu prosedürde başarıyla test edilmiş olsa da, hücre hattına bağlı değişkenlik ve farklılaşma verimlilikleri genel olarak dışlanamaz.

Bu şekil, tek hücreler halinde ekilen ve yaklaşık %60 verimle başarıyla farklılaştırılan, disosiye edilmiş dördüncü gün nöroektodermal hücrelerini göstermektedir. Çoklu titrasyon platformunda EBS kullanımı başlangıçta biraz eğitim gerektirir, ancak bir süre sonra bunun oldukça kolay olduğunu göreceksiniz.