Bir Multiplex Antikor Tarama Yöntemi kullanılarak bir Luminex xMAP Tahlil için bir Capture ELISA Dönüşüm

Aşağıdaki deneyin genel amacı, TNF Alpha sitokini için önceden optimize edilmiş bir Eliza analizini, alternatif antikor çiftlerini değerlendirirken Xap platformuna dönüştürmektir. Bu işlem, ELIZA kitindeki yakalama antikoru ile diğer üç aday yakalama antikorunun, birlikte karıştırıldığında dört farklı mikroküre veya boncuk setine bağlanmasıyla gerçekleştirilir. Bu dört set, en iyi antikor çiftini belirlemek için dört ayrı deteksiyon antikoru ile tüm dört adayın eş zamanlı olarak test edilmesine olanak tanır.

Sonraki iki Xap analizi, en optimal iki antikor çifti ile oluşturulur. Ardından, analizlerin performansı; sinyal gücü, dinamik aralık ve hassasiyet açısından orijinal EISA analizi ile karşılaştırılır. Sonuçlar, benzer antikorların aynı koşullar altında oldukça farklı performanslar gösterebileceğini ve Luminex Xap analizi kullanılarak birçok antikoru aynı anda taramanın mümkün olduğunu ortaya koyarak, bu analizle EISA'ya kıyasla artırılmış hassasiyet ve dinamik aralık elde edildiğini göstermektedir.

Bu tekniğin EIS A gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, xap tabanlı immünosayımların araştırmacının birden fazla hedefi test etmesine veya bu vakada olduğu gibi, birden fazla antikoru eş zamanlı olarak test etmesine olanak tanımasıdır. En iyi antikoru belirlemek için izlenecek prosedür, Luminex Corporation'da yardımcı bilim insanı olan Erica Lopez tarafından gösterilecektir.

Bu protokole, yazılı protokolde açıklandığı üzere, insan TNF alpha'ya özgü dört yakalama antikoru ve dört saptama antikorunun seçimi ve hazırlanması ile başlayın. Ayrıca, yakalama antikorlarının konakçı türüne özgü bir konfirmasyon antikoru hazırlayın. Antikor bağlama kitindeki reaktifleri oda sıcaklığına getirin.

Kenetleme reaksiyonu için seçilen boncuk bölge numaralarıyla dört reaksiyon tüpünü etiketleyin. Dört mag plex mikroküre şişesinin içeriğini etiketlenmiş dört reaksiyon tüpüne aktarın. Boncuk setlerinin her birini 500 µL aktivasyon tamponu ile iki kez yıkayın ve antikor kenetleme kitinde açıklandığı şekilde her bir boncuk setini sulf ONHS ve EDC çözeltileri ile aktive edin.

Kullanım kılavuzu: Rotatör üzerinde 20 dakikalık inkübasyonun ardından, artık aktive olmuş boncuklarla önceki yıkama adımını 500 µL aktivasyon tamponu ile toplamda üç kez tekrarlayın. Her yıkama için, her biri 7,5 µg yakalama antikoru inaktivasyon tamponu içeren dört ayrı 500 µL çözelti hazırlayın.

Bu dört yakalama antikoru çözeltisini ilgili reaksiyon tüplerine ekleyin. Her tüpü hemen vorteksleyin ve bir rotatör üzerinde iki saat inkübe edin. Antikor bağlama kiti ile birlikte verilen yıkama tamponunun 500 microliters miktarı ile, artık bağlanmış olan boncuklar için yıkama adımını toplam üç kez tekrarlayın.

Son yıkama adımından sonra, mililitre başına 5 milyon antikor bağlı boncuk nihai stok konsantrasyonu sağlamak için her reaksiyon tüpüne 500 mikrolitre yıkama tamponu ekleyip vorteksleyin ve ardından boncukları dağıtmak için reaksiyon tüplerini sonikasyona tabi tutun. Bağlama reaksiyonu sonrası geri kazanılan boncuk sayısını bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak sayın. Bağlama reaksiyonundan geri kazanım tipik olarak %90'ın üzerindedir. Her set için analiz tamponu içinde mikrolitre başına 100 boncuk nihai konsantrasyonda bağlı boncuk stoklarının test çözeltilerini hazırlayarak ve FICO eritrosit işaretli antis türünün dilüsyonunu hazırlayarak bağlama reaksiyonunun başarılı olduğunu doğrulayın.

Deney tamponu içerisinde mililitrede dört mikrogram konsantrasyondaki IgG konfirmasyon antikorundan, yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına, her bir test çözeltisinden toplam 16 kuyucuk olacak şekilde dört kuyucuğa 50 mikrolitre şeklinde dağıtın. Ardından, arka plan ölçümü yapmak için sekiz kuyucuğa 50 mikrolitre deney tamponu ve kalan sekiz kuyucuğa 50 mikrolitre seyreltilmiş konfirmasyon antikoru ekleyin. Reaksiyonları, çok kanallı bir pipetle birkaç kez yukarı-aşağı pipetleme yaparak nazikçe karıştırın.

Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında, bir plak sallayıcı üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin. Boncukları çözeltiden ayırmak için plakayı bir ila iki dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin. Ardından, plaka ayırıcı üzerindeyken plakayı bir atık kabının üzerinde kuvvetlice ters çevirerek sıvıyı uzaklaştırın.

Her bir kuyucuğa 100 µL assay tamponu ekleyip SANE'yi plakadan benzer şekilde uzaklaştırarak iki kez yıkayın. Manyetik plaka ayırıcıyı kullanarak, çok kanallı bir pipetle beş kez nazikçe yukarı aşağı pipetleme yaparak boncukları 100 µL assay tamponunda yeniden süspanse edin. Magix cihazı gibi bir luminex xap cihazında analiz edin.

Bu reaksiyonun floresan sinyalinin şiddeti, boncukların yüzeyindeki protein miktarıyla doğrudan orantılıdır ve böylece boncuklara bağlanan proteinin göreceli miktarının hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Xap analizindeki en etkili antikor çiftini belirlemek için, her bir boncuk setinden 10 µL'yi 0,96 mL analiz tamponuna ekleyerek dört boncuk setinin başlangıç karışımını hazırlayın. Her bir antikoru analiz tamponu içinde 1 µg/mL olacak şekilde seyrelterek deteksiyon antikoru çözeltilerini hazırlayın.

Ayrıca bir analiz tamponudur. R&D Systems TNF alpha protein standardını 2000 picograms per milliliter konsantrasyonda hazırlayın ve Streptavidin R FICO eryn'i eight micrograms per milliliter olacak şekilde seyreltin. Tarama analizi için, antikorla eşleştirilmiş boncuk karışımının 50 microliters'ını, CoStar yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu bir plakanın 16 kuyucuğunun her birine ekleyin.

Ardından, arka planı ölçmek için 16 kuyucuğun sekizine 50 µL analiz tamponu ekleyin. Daha sonra, yanıtı ölçmek için diğer sekiz kuyucuğa 50 µL TNF alpha standardı pipetleyin. Bir analiz plakası çalkalayıcı üzerinde sallayarak, oda sıcaklığında ve ışıktan korunaklı bir ortamda bir saat boyunca inkübe edin.

Ardından, ikisi arka plan kuyucuğu ve ikisi yanıt kuyucuğu olan dört kuyucuğun her birine, dört saptama antikorunun her birinden 50 µL ekleyin. Tüm kuyucuklara 50 µL SAPE reaktifi ekledikten sonra aynı koşullar altında 30 dakika boyunca inkübe edin. Aynı koşullar altında 15 dakika daha inkübe edin.

Plakayı bir dakika boyunca manyetik plaka separatörüne yerleştirin. Ardından, plaka separatör üzerindeyken, plakayı bir atık kabı üzerinde kuvvetlice ters çevirerek sıvıyı uzaklaştırın. 16 kuyucuğun her birine 100 µL assay tamponu pipetleyin.

Ardından, manyetik ayırma yöntemiyle boncuklardaki sıvıyı uzaklaştırın. Sonra, 16 kuyucuğun her birine 100 µL assay tamponu ekleyin. Plakayı, uygun çalışma prosedürü için kullanıcı kılavuzuna başvurarak Luminex mag picks cihazı ile okuyun.

İstenen sinyal gücünü karşılayan bir antikor çifti seçin. En iyi yakalama antikorunu seçtikten sonra, bu antikora bağlanmış boncuk stok çözeltisinin 100 µL'sini assay tamponu ile 10 mL'ye seyreltin. Seyreltilmiş boncukların 50 µL'sini, iki adet CoStar yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu plakanın 78 kuyucuğuna ekleyin.

Her bir plaka, farklı bir saptama antikorunun performansını değerlendirmek için kullanılacaktır. Ardından, R&D Systems ürünleri ile mililitrede 8.000 pikogramdan başlayıp mililitrede dört pikograma kadar uzanan 12 noktalı bir standart eğri hazırlayın.

TNF Alpha standardı için, her bir seyreltmeden altı adet 50 microliter tekrarlanan örneği her bir plakaya ekleyin; ayrıca arka plan için her birinde 50 microliter assay buffer bulunan altı kuyucuk ekleyerek plaka başına toplam 78 kuyucuk oluşturun. Plakaları, bir assay plate shaker üzerinde sallayarak, oda sıcaklığında ve ışıktan korunaklı bir şekilde bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, ilk plakanın tüm 78 kuyucuğuna 50 microliter ilk deteksiyon antikoru ekleyin.

İkinci plaka üzerindeki ikinci saptama antikoru için işlemi tekrarlayın. Plakaları aynı koşullar altında 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, her plakanın tüm kuyucuklarına 50 µL SAPE reaktifi ekleyin.

İki plakayı ışıktan koruyarak 15 dakika boyunca çalkaladıktan sonra, plakaları bir dakika boyunca manyetik plaka ayırıcılara yerleştirin. Ayırıcı üzerindeyken plakayı bir atık kabının üzerine kuvvetlice ters çevirerek sıvıyı uzaklaştırın. Ardından, manyetik boncuklardan gelen sıvıyı daha önce uzaklaştırdıktan sonra, plakalardaki 78 kuyucuğun her birine 100 microliters analiz tamponu pipetleyin.

Plakalardaki 78 kuyucuğun her birindeki boncuklara yüz mikrolitre analiz tamponu ekledikten sonra, uygun çalışma için kullanıcı kılavuzuna başvurarak plakaları mag picks cihazında analiz edin. R&D Systems, human TNF Alpha TNF SF1a DUO set ELISA kiti ile birlikte verilen talimatları izleyin. R&D kitiyle birlikte sağlanan standart tarafından oluşturulan yanıtı ölçün.

R&D Systems yakalama ve tespit antikorlarını diğer tedarikçilerin antikorlarıyla değiştirerek ELI assay'ini üç kez daha tekrarlayın. Kolaylık sağlamak adına, antikorları tedarikçiye göre eşleştirin ve her bir çifti, EISA formatının gerektirdiği şekilde üç TNF Alpha protein standardının her biriyle bağımsız olarak değerlendirin. Luminex Xap assay'leri, Mag PLX mikrokürelerine bağlanmış dört set TNF alpha antikoru kombinleyerek dört yakalama antikorunun tamamını bir karışım olarak değerlendirmek için multiplex şeklinde gerçekleştirildi; yakalama antikorları, biotinillenmiş dört tespit antikorunun her biriyle ayrı ayrı değerlendirilerek, bir tespit antikorunun dört yakalama antikorunun her biriyle olan etkileşiminin eş zamanlı olarak belirlenebilmesi sağlandı.

Sonuçlar, R&D Systems DUO setindeki antikor çiftinin, 6.183 medyan floresan yoğunluğu veya MFI birimlik bir yanıtla en iyi performansı gösterdiğini belirtmiştir. Ayrıca, Millipore ve ABAM'dan gelen saptama antikorlarının, RD Systems yakalama antikoru ile birleştirildiğinde XAP analizinde makul bir yanıt verdiği; Millipore, ACAM ve Novus'tan gelen yakalama antikorlarının ise XAP analizinde daha az istenen bir yanıt ürettiği gözlemlenmiştir. Dört antikor çiftini bir EISA formatında karşılaştırmak için R&D Systems DUO set protokolü kullanılmıştır.

Günümüzde yaygın olarak kullanılan tipik EIA protokollerini yansıttığı ve xap teknolojisiyle kullanılan protokollere benzediği için, tüm antikor çiftlerinde r and d systems protokolü uygulanmıştır. EISA testleri, r and d systems'den alınan antikor çiftinin yeniden en iyi sonuçları verdiğini göstermiştir. Antikor reaktivitesindeki herhangi bir varyasyonu değerlendirmek amacıyla kullanılan Acam antikor çifti hiçbir yanıt üretmezken, Millipore ve Novas antikor çiftleri düşük düzeyde yanıtlar üretmiştir.

Standart ile birlikte, dört antikor çiftinin tamamı, üç farklı tedarikçiden alınan üç farklı rekombinant TNF alfa protein standardı ile test edildi. Veriler, üç tedarikçiden gelen rekombinant TNF alfa protein standartlarının eşdeğer sonuçlar verdiğini göstermektedir. R&D Systems'den alınan TNF alfa proteini, ELSA ve XAP analizleri ile standart eğriler oluşturmak için kullanılmıştır.

ELI A analizi R&D Systems antikor çifti ile gerçekleştirilirken, Xap analizlerinde R&D Systems yakalama antikoru ile birlikte R&D Systems veya Millipore saptama antikoru kullanılmıştır. R&D Systems'den temin edilen TNF alfa proteini, yalnızca 8.000 ile 4 pg/mL arasında değişen konsantrasyonlar oluşturacak şekilde seyreltilmiştir. R&D Systems'e ait antikor çifti, Xap analizinde gösterildiği üzere 20.000 MFI'den daha yüksek bir yanıtla beklenen sonucu vermiştir.

Xap analizi için R&D Systems tespit antikoru yerine Millipore tespit antikoru kullanıldığında, yanıt RD Systems tespit antikoru ile elde edilen yanıtın yaklaşık %30'u kadardı. Bu grafikteki yeşil çizgi, üretici tarafından önerilen TNF alpha aralığı 16 ila 1000 picograms per milliliter olan ELISA'nın standart eğrisini temsil etmektedir. Spektrofotometrenin limitleri nedeniyle, ELISA analizinin aralığını artırmak mümkün olmamıştır.

Ayrıca, her iki yöntemin dinamik aralığı ve hassasiyeti, logaritmik ölçekte çizildiğinde daha iyi şekilde örneklendirilmektedir. EISA yanıtının eğimi ile xap analizlerinden gelen yanıtlar arasındaki belirgin fark görülebilmekte ve bu durum, EL iza'nın hem daha yüksek hem de daha düşük konsantrasyonlarda TNF alpha tespiti için daha sınırlı bir kapasiteye sahip olduğunu daha net bir şekilde göstermektedir. İki fonksiyonel TNF alpha xap analizi için tespit sınırları veya LOD, arka plan seviyesinden daha yüksek bir yanıt düzeyinin gözlemlendiği en düşük TNF alpha konsantrasyonunun, altı tekrardan elde edilen standart sapmasının (SD) üç katı eklenerek yaklaşık olarak belirlenmiştir.

Burada, R&D Systems çifti kullanıldığında, 3,91 pg/mL'lik en düşük TNF alfa konsantrasyonunun, arka plan artı üç standart sapma kriterini karşılayan 66 MFI'lık bir yanıt oluşturduğu gözlemlenebilir. Millipore deteksiyon antikoru R&D Systems yakalama antikoru ile birlikte kullanıldığında ise tespit limiti 7,81 pg/mL'den daha düşükle çıkmıştır.

Bu durumda, kabul edilebilir yanıt olarak üretilen ikinci en düşük TNF alpha konsantrasyonunun 17 MFI'lık değeri, en düşük TNF alpha konsantrasyonunun yanıtı ile bu yanıtın standart sapmasının üç katı toplamından daha büyüktür. Benzer şekilde, r and d systems duo set Eliza için tespit sınırı 63 ile 31 picograms per milliliter arasında olduğu tahmin edilmiştir. Bu prosedürü takiben, xap analizini daha fazla optimize etmek amacıyla test etme, çeşitli örnek matrisleri veya raporlayıcıdaki antikor konsantrasyonları gibi diğer adımlar gerçekleştirilebilir.