Nanodisc Lipid Parçacıklar içine bir ABC Transporter Sulandırma için bir adım-adım yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, bir A, b, C taşıyıcısını, bu durumda maltoz taşıyıcısı malf GK ikisini, çözünür membran nano disk partiküllerine dahil etmektir. Bu işlem, öncelikle membran iskele proteini MSP'nin, taşıyıcı ve uygun miktardaki lipidlerle deterjan miselleri içinde karıştırılmasıyla gerçekleştirilir.

İkinci adım, polistiren boncukların eklenmesi ve karışımın gece boyunca nazikçe sallanmasıdır; deterjan kademeli olarak boncuklar tarafından absorbe edilir ve böylece nano disk partiküllerinin oluşumu sağlanır. Ardından, boncuklar sedimentasyon yoluyla uzaklaştırılır. Son adım ise, uygun şekilde oluşmuş disklerin agregatlardan ve birleşmemiş iskele proteinlerinden jel filtrasyon kromatografisi ile ayrılmasıdır.

Son olarak, disklerin kalitesi doğal jel elektroforezi veya ışık saçılım spektroskopisi ile değerlendirilir. Bu tekniğin lipozomlar gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, membran proteinlerinin ve disklerin sulu çözeltide tamamen çözünür olmasıdır. Ayrıca, protein domenleri artık her iki taraftan da erişilebilirdir.

Artık bir membran kompartımanı bulunmadığından, farklı uzunluklardaki membran iskele proteinlerini kullanarak membran proteinlerinin farklı ligand durumlarını hapsetmeyi ve incelemeyi başardım. En önemlisi, bu yöntem membran proteomik alanı içindeki, a, b, C taşıyıcılarının yeni bağlanma ortaklarının tanımlanması gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Aslında, bu tekniğin etkileri, membran proteinlerinin ve reseptörlerinin aktivatörlerinin veya inhibitörlerinin keşfine yardımcı olabileceği için terapiye kadar daha geniş bir alana yayılmaktadır.

Bu yöntem basit görünse de, doğru protein-lipid oranı seçilirken dikkatli olunmalıdır. Genellikle bu yöntemde yeni olan kişiler, doğru kalıp oranını hesaplamakta veya hazırlığın kalitesini garanti altına alan doğru kontrolü gerçekleştirmekte zorlanırlar. Bu nedenle, bu yöntemin görsel bir gösterimi, yeni bir öğrencinin çeşitli adımları ve karşılaşılabilecek zorlukları öğrenmesi açısından oldukça faydalıdır.

E. coli BL 21(DE3) suşunda P-MSSP1D1 plazmidi kullanılarak heksa-histidin etiketli MSP üretimine başlamak için, 600 nanometrede ölçülen optik yoğunluk yaklaşık 0,5 olduğunda protein üretimini indükleyin ve 37 °C'de üç saat boyunca sürdürün; ardından hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 5.000 ×g merkezkaç kuvveti ile hasat edin. Peleti 100 µM PMSF içeren TSG 10 tamponunda yeniden süspande edin ve hücreleri bir French press ile 8.000 PSI'da üç kez parçalayın. Çözünmeyen materyali 4 °C'de 10 dakika boyunca 5.000 ×g merkezkaç kuvveti ile uzaklaştırın. Ardından, MSP içeren çözünür fraksiyonu 45 dakika boyunca 125.000 ×g ultrasentrifüj ile izole edin.

MSP'yi, TSG 10 tamponu içindeki yaklaşık 1,5 mililitre nikel seros yüksek performanslı kolon kullanarak nikel şelatlama kromatografisi ile saflaştırın. Kontaminantları, 50 milimolar imidazol içeren TSG 10 tamponu ile yıkayarak uzaklaştırın. Diyaliz işleminden sonra, MSP'yi 600 milimolar imidazol içeren TSG 10 tamponu ile elüe edin.

TSG 10 tamponu içindeki saflaştırılmış MSP proteini, -70 °C'de ve yaklaşık 10 ila 15 mg/mL protein konsantrasyonunda saklanabilir. MAL K'nın C terminusinde his-etiketli olan MALF GK 2 kompleksi, plazmid PED 22 FG K'dan eksprese edilir. E coli BL 21 DE3 suşunda büyütülen hücrelerde, 600 nm'de ölçülen optik yoğunluk yaklaşık 0,5 olduğunda, %0,2 L-arabinoz ile 37 °C'de üç saat boyunca protein üretimi indüklenir; ardından hücre lizizi ve santrifüj işlemleri gerçekleştirilir.

Daha önce olduğu gibi, membran peletini nihai konsantrasyonu beş mg/mL olacak şekilde TSG 20 tamponunda süspande ediyoruz. Ardından, materyali %1 ağırlık/hacim GDM ile dört °C'de, hafif çalkalama eşliğinde üç saat boyunca solubilize edin. Çözünmeyen materyali, MAL FTK iki saflaştırmasında olduğu gibi ultrasantrifüjasyon ile uzaklaştırın.

Ardından, çözünür hale getirilmiş mal FTK two kompleksini içeren süpernatantı toplayın ve nikel şelatlama kromatografisi ile yeniden saflaştırın. Kompleksi, SUEx 200, HR ten üç yüz kolonunda, TSGD tamponunda, dakikada 0.5 milliliters akış hızında jel filtrasyon kromatografisi ile daha fazla saflaştırın. Fosfolipidleri hazırlamak için, kloroformda çözülmüş bir e coli toplam lipid ekstraktını vidalı kapaklı mikrofüj tüplerine 1000 anomal alikotlar halinde ayırın; solventi hafif bir azot akımı altında buharlaştırın ve vakumda gece boyunca kurutmaya devam edin.

Ardından kurutun, lipid filmini beş NMO son konsantrasyonundaki TS tamponunda çözün ve kuvvetlice vorteksleyin, ardından yaklaşık beş saniye boyunca beş kez darbeli sonikasyon uygulayın. Çözünmüş lipidler, sulu TS tamponundaki genel çözünmezlikleri nedeniyle hafif opak görünecektir ancak süspansiyon halinde kalmalıdırlar. DDM'yi 0,5% son konsantrasyona ulaşacak şekilde ekleyin. Bu noktada çözelti berraklaşacaktır; lipid karışımını bir su banyosuna yerleştirin ve yaklaşık beş saniye boyunca beş kez darbeli sonikasyon uygulayın.

Lipit karışımı, dört °C'de maksimum bir hafta boyunca saklanabilir. Bio bead'leri hazırlamak için, 50 mL'lik bir tüpe yaklaşık 10 ila 15 mL bio bead yerleştirin. İlk olarak, bead'leri 50 mL %100 metanol ile yıkayın.

Boncukların yerçekimi ile çökmesini bekleyin ve ardından çözeltiyi nazikçe dökün. Bu işlemi metanol için bir kez, ardından 95% Ethanol, milli Q water ve son olarak TS buffer için ikişer kez tekrarlayın. MSP'yi TSGD buffer içinde yaklaşık 7 mg/mL veya 0.3 mM son konsantrasyona seyrelterek nano ayrık yapılandırmaya başlayın.

Deneyin başarılı olması için, birlikte karıştırılacak lipid ve proteinlerin doğru oranlarının seçilmesi önemlidir. Yaklaşık iki M saflaştırılmış malf GK iki kompleksini, TSGD tamponu içerisinde, protein:MS P:lipid oranı 1:3:60 olacak şekilde toplam 300 µL hacme tamamlayarak karıştırın. Burada, negatif kontrol olarak 1:3:400 oranında fazla lipid içeren bir örnek de hazırlanmıştır. Tüpe 50 µL bio bead süspansiyonu ekleyin ve karışımı bir sallama tablası üzerinde, 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, boncukları yerçekimi yardımıyla çöktürün. Boncuklar çöktükten sonra, mümkün olduğunca az bio bead alacak şekilde çözeltiyi dar bir uç yardımıyla pipetleyin.

Büyük çökelekleri 100,000 GS'de 20 dakika boyunca ultrasantrifüj yaparak uzaklaştırın. Diskleri, daha önce TSG 10 tamponunda gerçekleştirildiği şekilde jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırmaya geçin. Ardından, hazırlığın stabilitesini test etmek için aynı jel filtrasyon kolonuna bir Eloqua enjekte edin.

Ardından diskleri içeren fraksiyonları birleştirin. Hazırlığın kalitesi native jel elektroforezi ile değerlendirilir. Rekonstitüsyon kalitesini değerlendirmek için bir mikromolar nano disk analiz edin.

Ayrıca, nano disklerde yeniden oluşturulan mal E ile mal ftk two kompleksinin bağlanmasını değerlendirin. Elektroforezden sonra, jeli 10 dakika boyunca kumasi blue ile boyayın ve yaklaşık bir saat boyunca boyayıyı giderin. Dinamik ışık saçılımı veya DLS gerçekleştirmek için, önce nano diskleri daha önce olduğu gibi, 0,1 mililitre/dakika akış hızında bir SUEx 200 HR ten üç yüz kolonu kullanarak jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırın.

Nano diskler içeren fraksiyonları birleştirin ve bir AmCon santrifüj filtresi ile yaklaşık 10 mg/mL konsantrasyona getirin. Ardından örneği iki kez filtreleyin. Analizi, bir mikrolitre iç hacimli kuvars vete fit veri içeren bir dynapro nano star cihazı kullanarak DLS ile gerçekleştirin.

Parçacıkların çapını ve molekül ağırlığını tahmin etmek için dinamik yazılımı kullanarak, kolörimetrik bir analiz ile iki yeniden oluşturulmuş mal FTK nano disklerinin ATPase aktivitesini belirleyin. İlk olarak, bir mikromolar saflaştırılmış diskleri ve bir milimolar ATP'yi artan miktarlarda mal e ile karıştırın. Numuneleri 37 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, inorganik fosfat salınımını 660 nanometrede ölçün. Salınan fosfat miktarını, bir fosfor standart çözeltisi ile oluşturulan standart eğriyle karşılaştırın. Nano diskler, jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırılır.

Kromatogram, yeniden oluşturulan disklerin çoğunluğunun tek bir pik olarak elüe olduğunu, buna karşın fazla lipid ile hazırlanan disklerin boşluk hacminde ve bir dizi geniş pik şeklinde elüe olduğunu göstermektedir; disk hazırlama kalitesi, yerli jel elektroforezi ile daha ayrıntılı şekilde analiz edilmiştir. Sınırlı miktarda lipid ile yeniden oluşturulan diskler yerli jelde keskin bir bant olarak göç ederken, fazla lipid varlığında yeniden oluşturulanlar yayılmalar (smear) şeklinde göç etmektedir. DLS analizi, disk popülasyonunun 5.0 nanometre ortalama yarıçap ile homojen olduğunu göstermektedir. DLS yaklaşımına dayanarak, yeniden oluşturulan disklerin 215 kilodalton görünür moleküler ağırlığa sahip olduğu saptanmıştır; fazla lipid varlığında yeniden oluşturulan örnekler, homojen olmayan örnekler için tipik olan 100 nanometre civarında geniş dağılımlı yarıçaplar sergilemektedir.

MAL FTK iki kompleksinin aktivitesi, TP hidroliz hızı ve maltoz bağlayıcı protein MAL E gibi etkileşim ortaklarına olan afinitesinin ölçülmesiyle değerlendirilir. MAL E, denatüre etmeyen jel elektroforezi kullanılarak MAL FTK iki taşıyıcısına yüksek afinite ile bağlanır. MAL E ile MAL ftk iki arasında bir kompleks tespit etmek mümkündür; MAL KA TPA aktivitesinin MAL E tarafından stimülasyonu, burada MAL e konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak gösterilmiştir.

Nano disklerin hazırlanması nispeten basittir, ancak optimal koşullardan meydana gelen küçük sapmalar geri dönüşümsüz protein agregasyonuna yol açabilir; bu teknik bir kez kavrandığında, iki günden daha kısa sürede tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, doğru protein-lipid oranını seçmenin önemi unutulmamalıdır; çünkü aşırı miktarda lipid, büyük ve polidisperze lipozom benzeri partiküllerin üretilmesine neden olacaktır. Rekonstitüe edilen materyalin kalitesini, jel filtrasyonu dışındaki tekniklerle (ışık saçılım spektroskopisi, analitik ultrasantrifüjasyon veya daha basitçe doğal jel elektroforezi gibi) dikkatle analiz etmek kritik öneme sahiptir.

Unutmayın, diski oluşturan fosfolipid türü ve membran iskelet proteininin türü, yeniden oluşturma verimliliğine katkıda bulunabilir. Bu videoyu izledikten sonra, seçtiğiniz membran proteinini içeren çözünür ve homojen nanodisklerin nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayış kazandığınızı umuyoruz. Deneylerinizde başarılar dileriz.