Üzerine Hipoksi Etkileri Eğitim için tanımlı Gazlı ortamlar oluşturma

Bu deneyin amacı, sürekli akış yöntemini kullanarak bir hipoksi odası kurmak ve bunu sürdürmektir. Bu işlem, prosedür için gerekli tüplerin, balonların ve odacıkların temin edilmesi ve hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, oksijen tankı bağlanır ve istenen hipoksi düzeyini oluşturmak için akış hızı seçilir.

Gazı, deiyonize su ile doldurulmuş bir kabarcık balonundan geçirerek nemlendirin. Nemlendirilmiş gazı hipoksi kamarasına bağlayın ve test örneklerini hipoksik koşullara maruz bırakmak için kamaraya yerleştirin. Erişkinliğe kadar olan canlılık gözlemlenerek, hipokside Hi F1 bağımlı embriyonik letaliteyi gösteren sonuçlar elde edilir.

Bu tekniğin glove box gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, laboratuvar ortamında kolay ve düşük maliyetle üretilebilmesi ve çevre odasındaki gaz konsantrasyonunun doğru vele tekrar edilebilir şekilde sağlanmasıdır. Bu yöntem, nematode C elegance modelinde hipoksik yanıta dair bilgiler sunmasının yanı sıra, daha büyük model organizmalar ve hücre kültürü dahil olmak üzere diğer sistemlere de uyarlanabilir. Ayrıca, karbondioksit ve hidrojen sülfür dahil olmak üzere diğer gazların incelenmesi için de kullanılabilir.

Bu protokol, bir hipoksi odasının nasıl kurulacağını göstermektedir. Gaz, belirlenmiş oksijen konsantrasyonlarına sahip sıkıştırılmış gaz tüplerinde saklanır ve bir iki aşamalı regülatör bağlanır. Gaz, akış tüpünün altına girer ve doğru akış hızında üstten çıkar.

Gaz daha sonra, gazı nemlendiren balon flaskına akar. Ardından hidro gaz, giriş valfinden hipoksi odasına geçerek örnekleri hipoksiye maruz bırakır. Gaz son olarak, oda içerisine, hazneye açılmış bir egzoz deliği aracılığıyla tahliye edilir.

Çevresel odanın gövdesi olarak bir Pyrex kristalizasyon kabı veya bir ok paket kutusu kullanılabilir. Kabın hacmi minimum düzeyde tutulmalı ve materyal gaz geçirmez olmalıdır. Kabın bir yanına karbon veya elmas uçlu matkapla bir delik açın ve buraya plastik bir hortum rekoru takın.

Epoksiyi kutuya ve bağlantı parçasına uygulamadan önce karıştırın. Ardından, konteynerin karşı tarafında, ikinci deliği birinciden farklı bir konuma getirerek aynı prosedürü tekrarlayın. Türbülanslı karıştırmayı artırmak için, sıkıştırılmış gaz tanklarını kütle akış kontrolörü veya rotametre gibi bir akış kontrol cihazına bağlamak amacıyla sekizde bir inç dış çaplı FEP veya naylon boru kullanın.

Gaz tankları, oksijen içeriği için sertifikalı bir standart veya anoksik koşullar için belirlenmiş, azot ile dengelenmiş oksijen konsantrasyonlarına sahip olmalıdır. Saf azot için, ikinci kademesi istenen basınca ayarlanmış iki kademeli bir regülatör kullanın. Uygun akış hızının seçimi için yazılı protokoldeki talimatlara bakın.

Ardından, iki aşamalı regülatörden gelen boruyu, hazneye giren gazın akış hızını kontrol eden akış tüpüne bağlayın. Akış tüpünün çıkışları, distile su içeren gözenekli silindirli bir gaz yıkama şişesine bağlanır. Daha sonra, yıkama şişesinin diğer tarafındaki boruyu çevresel haznedeki bağlantı parçalarından birine bağlayın.

Bu işlem, çevreleme odasına giren gazı nemlendirecektir. Odayı sızdırmaz hale getirmek için vakum gresi kullanın. Ardından, hava sızdırmazlığını sağlamak için odanın kapağına ağırlıklar yerleştirin.

Eldivenli bir elin avucunda az miktarda su tutarak, suyu oda üzerindeki gaz tahliye bağlantısına temas ettirip kabarcık oluşup oluşmadığını kontrol ederek sızdırmazlığı test edin. İlk olarak, senkronize sea Elgan popülasyonları oluşturun. 1 ila 100 adet GR yetişkinini, ekilmemiş bir nematod büyüme besiyeri plağının yüzeyindeki bir damla alkali çamaşır suyu çözeltisinin içine yerleştirin.

En az sekiz saatlik bir inkübasyon süresinin ardından çamaşır suyu çözeltisinin plağa emilmesini sağlayın. Senkronize edilmiş L1 larvalarını, canlı OP 50 bakterileri ekilmiş plağa aktarın. Alternatif olarak, senkronize şekilde gelişecek bir solucan grubu oluşturmak için GRA yetişkinlerin plak üzerine iki ila üç saat boyunca yumurta bırakmasına izin verin veya genç embriyolar toplamak için karışık bir popülasyondan L4 larvaları seçin.

İki ila dört hücreli evrede, GR yetişkinlerini küçük bir hacimdeki suyun içinde jiletle parçalayın ve ardından solüsyon pipeti kullanarak embriyoları, solucanları hipoksik koşullara maruz bırakmak üzere plağa aktarmadan önce transfer edin. Solucanların agar plak yüzeyinden kaçmasını önlemek için plakların kenarına etanol içinde 10 mg/mL palmitik asit halkası yerleştirin.

Palmitik asit çözeltiden ayrılacaktır. Etanol buharlaşarak tekdüzeliği sağlamak için fiziksel bir bariyer oluştururken, çevresel hazneye yerleştirmeden önce gaz yıkama şişesindeki suyu değiştirdiğinizden emin olun. Solucanları plakalara aktardıktan sonra, plakaları çevresel hazne içinde sızdırmaz hale getirin, gaz akışını başlatın ve analiz için istenen süre boyunca maruziyeti sürdürün.

Embriyoların erişkinliğe kadar canlılığını belirlemek için, solucanların oda havasına döndükten sonra 48 saat boyunca gelişmesine izin verin; bu noktada solucanlar dördüncü evre larva veya bir günlük erişkin olmalıdır, ardından erişkinliğe kadar olan canlılık skorlamasını yapın. Hipoksik maruziyete maruz kalan solucanları görselleştirmek için, solucanları 22 mm'lik kare bir lam üzerine M9 damlasına aktarın ve gerekirse %2'lik agar içeren M9 pedinin üzerine ters çevirin.

Anestezik olarak 25 millimolar amol veya 10 millimolar sodyum azid kullanılabilir. Alternatif olarak, hipoksiye maruz bırakıldıktan sonra, şeffaf ortam odası doğrudan bir diseksiyon mikroskobunun tablasına yerleştirilebilir. Biri tüm gaz akış düzeneğini içeren olmak üzere, iki görünüm gösterilmektedir.

Diğeri ise sadece mikroskop tablası üzerindeki hazne ile. Bristol N2 solucanlarını, solucanların çoğunluğu yetişkin GR olana kadar dört adet 10 santimetre yüksekliğindeki büyüme plakasında büyütün. Solucanları bir ila beş oranında alkali çamaşır suyu çözeltisi ile 15 mililitrelik konik bir tüpe yıkayın ve solucanlar çözünmeye başlayana kadar rotasyonla inkübe edin.

Beş dakikadan fazla olmamalıdır. Solucanları, her yıkama arasında plakayı sarsmadan 1.500 ×g'de çöktürerek üç kez M9 ile yıkayın. Ağartılmış embriyoları 8 adet 150 mm NGM plakasına aktarın ve embriyoların yaklaşık 48 saat boyunca L4 larvalarına kadar gelişmelerini bekleyin.

Plakaları 22 °C'de çevresel hazneye taşıyın ve dört saat boyunca veya deneysel tasarımda belirtilen süre boyunca hipoksik ve anoksik koşullara maruz bırakın. Örnekleri toplamak için hipoksik haznenin kapağını hızla açın. Bir örnek plağı alın, hazneyi tekrar kapatın ve adımları zamanlayarak kaydedin.

Solucanlar hipoksiden çıkardıktan sonra, tüm bu işlem iki dakikadan kısa sürmelidir. Solucanları naylon bir filtreye yıkamak için distile su kullanın ve ardından 100 µL %1 SDS içeren etiketli 15 mL'lik konik bir tüpe boşaltın. SDS içindeki solucanları bir masaüstü santrifüjde 1.500 ×g hızda 15 ila 20 saniye boyunca santrifüjleyin.

Mola verdiğinizde, solucan peleti bozulmadan tüpteki süpernatantın çoğunu uzaklaştırmak için bir vakum kullanın. Bir pipet yardımıyla solucan peletini, önceden belirlenmiş hacimde sıvı ile birlikte etiketlenmiş 1,5 µL mikro santrifüj tüpüne aktarın. Numune SDS-PAGE için kullanılacaksa, bu tüp eşit hacimde iki kat protein yükleme boyası içerebilir; tüpü kapatın ve sıvı azota daldırın.

Tüm örnekler izole edilene kadar işlemi tekrarlayın. Tutarlılık sağlamak için ev içi hava kontrol örneklerinde de bu prosedürleri uygulayın; örnekler -20 °C'de saklanabilir. Bu şekil, 1000 ppm oksijene, 5.000 ppm oksijene ve normoksiye (yaklaşık 210.000 ppm oksijen) maruz kalan embriyoların canlılığını göstermektedir.

Embriyolar, sürekli akışlı oksijen kameralarında her bir koşula 24 saat boyunca maruz bırakılır. Solucanlar normoksik koşullara aktarılarak 48 saat boyunca yetişkinliğe ulaşmaları sağlanmış ve ardından yetişkinliğe geçiş canlılığı açısından değerlendirilmiştir. Bu prosedürün ardından, Western blot, QPCR veya yaşam süresi ya da döl üretimi gibi fizyolojik analizlerle yapılacak sonraki incelemeler için örnekler toplanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, kendi laboratuvarınızda sürekli akışlı bir hipoksi odasının nasıl kurulacağı konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.