Azoxymethane (AOM) ve Dekstran Sülfat Sodyum (DSS) ile Modelleme Kolit-İlişkili Kanser

Sıfırıncı günde, Myer azoksimetan veya OM enjekte etti ve sonraki hafta içme suları dekstran sülfat sodyum veya DSS içeren bir solüsyonla değiştirildi. Üçüncü haftada, farelere sonraki iki hafta boyunca su verildi.

Bu DSS su döngüsü iki kez daha tekrarlanır. İkinci DSS döngüsünden sonra fareler, aynalı endoskopi ile tümörler açısından değerlendirilebilir.

10. haftadan sonra fareler sakrifiye edilir ve kolonlar toplanır. Kolonlar yıkanır ve boylamsal olarak açılır. Kolonlarda tümör boyutu ve tümör sayısı değerlendirilir.

Kolonun üçte birlik bölümlerden oluşan boylamsal bir kesiti gömülebilir ve histolojik analiz için gönderilebilir. Işık mikroskobu kullanılarak tümörler sayılabilir ve sınıflandırılabilir. Genotoksik ajan OM uygulaması ve ardından üç döngü pro-inflamatuar ajan uygulamasının yer aldığı bir protokol sunmaktayız.

DSS, farelerde morfolojik ve moleküler açıdan insanlardaki kolit ilişkili kanserlerle benzerlik gösteren kolon tümörlerini hızlı ve tutarlı bir şekilde oluşturur; sıfırıncı günde fareleri kuyruk işaretleri veya kulak klipleriyle tek tek etiketleyin, her farenin başlangıç ağırlığını bir tabloya kaydedin, ardından her fareye 10 mg/kg çözeltide OM uygulayın. Genotoksik bir ajan olduğu için OM ile çalışırken dikkatli olun; yedinci günde, farelere takip eden hafta boyunca içme suları olarak %2,5'lik DSS çözeltisi sağlayın. Bu çözeltiyi hazırlamak için, DSS tozunu distile suya ekleyin ve çözünene kadar karıştırın.

Çözelti, 0,2 mikronluk selüloz asetat filtreden geçirildikten sonra hazır hale gelir. Yedi gün boyunca sürekli DSS çözeltisi temini sağlamak için DSS'yi her iki ila üç günde bir yenileyin.

Bu sürenin ardından, kafesleri iki hafta boyunca tekrar suya geri döndürün. Fareleri haftada iki ila üç kez tartın ve rektal kanama ile diyare açısından gözlemleyin. Büyük tümörleri olan farelerde geçici olarak rektal prolapsus gelişebilir, ancak bu durum genellikle sağkalım yüzdesini düşürmez.

Baz çizgisine göre ağırlık kaybı, kolit şiddetinin sürrogat bir ölçümü olarak kullanılır. Tam bir DSS endoskopisi döngüsünü takip eden haftada, iki ila üç günlük ishal ve rektal kanama ile birlikte %10'a kadar ağırlık kaybı beklenebilir. Sakrifis öncesinde in vivo tümör büyümesini doğrulamak için ikinci veya üçüncü DSS döngüsü gerçekleştirilebilir.

A-O-M-D-S-S modeli tümör üretimi konusunda oldukça güvenilir olduğundan, bu adım genellikle gerekli değildir. Fare tümörlerini bozma potansiyeli olduğu için bu yöntemle yalnızca birkaç fare değerlendirilmelidir. Çalışma alanınızda steril fosfat tamponlu tuzlu su veya PBS içeren bir beher ile boş bir beher bulunmalıdır.

Kullanılmış PBS'yi uzaklaştırmak için, her kullanımda bir şırıngaya 8 ila 10 mililitre PBS çekip endoskoba takın. İntralüminal içeriği temizlemek için her bir fareyi inhale veya enjekte edilebilir sedasyonla anesteziye alın ve fareyi düz bir levhaya bantla kuyruk ve göğüs bölgesinden sabitleyin; farenin ayak tabanları sıkıştırılabilir. Yeterli sedasyonu sağlamak için, başparmağınız ve işaret parmağınızla farenin alt karnını sıkarak anüsü açığa çıkarın ve muren endoskopunu farenin rektumuna ilerletin.

İntralüminal görünümü iyileştirmek ve fekal içerikleri uzaklaştırmak için PBS kullanarak nazikçe şişirme ve irigasyon yapın. Monitörü izlerken endoskobu yavaşça ilerletmeye devam edin. 70. günde makroskobik tümörlerin varlığı için, her bir A-O-M-D-S-S uygulanmış farede çok sayıda kolon tümörü bulunmalı ve değerlendirme için hazır olmalıdır.

Daha büyük tümörler isteniyorsa, bu durum haftalarca veya aylarca geciktirilebilir. Gavage iğnesine takılı, PBS dolu bir şırınga hazırlayın. %10 formaline yüklü bir şırınga, temel cerrahi makaslar, küt uçlu makaslar.

%1 Ian Blue çözeltisi yüklü küçük bir şırınga ve ince pensler. Ayrıca, bir soğuk tepsi, soğutulmuş PBSA içeren bir taşıma kabı, kesme işlemi için yeni bir jilet ve %10 formalin ile doldurulmuş bir fiksasyon havuzu hazırlayın. Her bir fareyi izofluran ve servikal dislokasyon veya kurumca onaylanmış diğer bir yöntemle ötanize edin. Final ağırlık ve diğer ölçümler yapılabilir.

Bu aşamada, fareyi ventral tarafı yukarı bakacak şekilde bir kesme tahtasına yerleştirin. Tüyleri diseksiyon alanından uzak tutmak için karnı %70 ethanol ile spreyleyin. Karın orta hattını tutmak için pens kullanın ve peritonu açığa çıkarmak için deri üzerinden küçük bir insizyon yapın.

Cildi peritondan ayırmak ve tüm karın boşluğunu açığa çıkarmak için nazik traksiyon uygulayın. Peritonda bir insizyon yapın ve bu insizyonu her iki tarafta kostal marjin boyunca uzatın. İnce bağırsağı ve kolonu yana itmek için kapalı makas kullanın.

Bu işlem, isteğe bağlı olarak toplanabilen mezenterik lenf nodlarını açığa çıkaracaktır. Değerlendirme için, inen kolon ve rektumu açığa çıkarmak amacıyla genitoüriner sistemi inferior yönde süpürün; pelvisi daha fazla açığa çıkarmak için gerektiği şekilde mesaneyi ve üreme organlarını eksize edin. Bu sırada komşu dokulara zarar vermemeye dikkat edin.

Anal rektal bileşkeyi açığa çıkarmak için inferior ve superior pubik ramusları kesin. Kolonu serbest bırakırken nazikçe yukarı doğru traksiyon uygulayarak anal rektal bileşke çevresindeki cildi kesin. Mezenterik penset yardımıyla kolonun bağlantıları eksize edilebilir veya dikkatlice ayrılabilir.

Bu bölge sıklıkla displaziden etkilendiği için, anal rektal bileşke noktasındaki derinin bir kısmının korunması önemlidir. Kalın bağırsağı, sekumun hemen proksimalinden ince bağırsaktan ayırarak kesin. Beş mililitrelik bir şırıngaya takılı 18 gauge gavage iğnesi kullanarak sekumu bitişiğindeki kolondan ayırın.

Yuvarlatılmış uçlu makas kullanarak, sıvının fizyolojik yönde çıkmasını sağlayacak şekilde kolon buz soğukluğunda PBS ile yıkayın. Kolonu mezenter boyunca açın. Açık kolonu soğuk tepsiye yayın.

Tepsinin, dokuyu dondurmayacak kadar yeterince çözündüğünden emin olun. Tümörleri daha iyi görüntülemek için parmağınızla birkaç damla %1 Alan Blue uygulayın. Bir cetvel yardımıyla tümör sayısını ve boyutunu değerlendirin veya dijital analiz için fotoğraflarını çekin.

Tümörden küçük kesitler ve bitişik normal dokular, RNA proteini veya immünohistokimyasal yöntemlerle gelecekteki analizler için bu aşamada eksize edilebilir; kolonun bir kısmı histolojik değerlendirme için bırakılmalıdır. Soğuk tepsideki kalan kolona şırınga veya parmak yardımıyla %10'luk formalin uygulayın ve dokunun en az 30 saniye boyunca fikse olmasına izin verin. Bu yöntem, fiksasyon havuzuna aktarımı kolaylaştırır.

Aynı tepside yeni bir açık kolon boyamadan önce, kalıntı formalinlerin silindiğinden emin olun. Kolonu, %10 formalin ile dolu bir kaba aktarın ve kenarlarından iğneleyin. Üç saatlik fiksasyondan sonra formalini dökün ve yerine %70 etanol ekleyin.

Kolonlar %70 etanol içerisinde süresiz olarak saklanabilir. %2 agar çözeltisi hazırlamak için düşük ısı kullanın ve cam bir plaka üzerine temiz bir lam yerleştirin. Tespitlenmiş kolonu üç parçaya bölün ve kullanılmayan parçaları etanol havuzuna geri koyun.

İki jilet kullanarak bölümleri tek tip boyuta getirin. Kolon bölümlerini ve katmanlarını temiz lam üzerindeki agara gömün. Bu işlemi bir sonraki kolon için tekrarlayın.

Kesitleri kesin, fazla agarı temizleyin ve gömülü kolonu işleme ve hematoksilin ile eozin boyaması için bir kasede yerleştirin. Şekil bir, kolit ilişkili kanser indüksiyonu protokolünü özetlemektedir. Şekil iki, OM ve DSS uygulaması sırasında farenin bazal değere göre ağırlığını göstermektedir.

Her DSS döngüsünü takip eden haftada, farelerin vücut ağırlıklarının %5 ila 10'unu kaybettiğine dikkat edin. Bu deneydeki ağırlık kaybı, kolit şiddeti için bir vekil belirteçtir. Şekil 3, A-O-M-D-S-S tedavisinin 50. gününde distal kolondaki tümörlerin fare endoskopisi ile görünümünü göstermektedir.

B ve C panellerinde, normal kolona kıyasla distal kolon lümenini tıkayan çok sayıda polipoid kütleye dikkat edin. Panel a'daki şekil dört, tümörlerin makroskobik görünümünü gösteren boylamasına açılmış bir fare kolonunu göstermektedir. Distal kolondaki daha yüksek tümör yüküne ve proksimal kolonun az tümör büyümesiyle birlikte karakteristik tırtıklı dokusuna dikkat edin.

Şekil beş, lc ve mavi boya uygulamasıyla belirginleştirilmiş tümörleri göstermektedir. Boyanın, kolonun normal dokusunun yanı sıra her bir bireysel tümörün sınırlarını nasıl vurguladığına dikkat edin. Bu tür bir boyama, tümör alanlarının cetvel veya dijital ölçümle hassas bir şekilde ölçülmesinde faydalı olabilir.

Şekil altı, OM ve DSS ile tedavi edilen fare başına ortalama tümör sayısının temsili dağılımını göstermektedir. Tümörlerin çoğunluğunun distal kolonda yer aldığına ve boyutlarının iki milimetreden küçük olduğuna dikkat edin. Şekil yedi, bir kaset içindeki kolonun parafinle gömülmüş boylamasına kesitlerini ve H&E boyama lamını göstermektedir.

S kalıntılarının ve mavi boyanın H&E boyamasını etkilemediğine dikkat edin. Slayt görüntüsünde büyük bir tümör daire içine alınmıştır. Distal, orta ve proksimal tanımlamaları, tüm kolonun sekum ile anüs arasında üç eşit parçaya bölünmesiyle elde edilmiştir.

Şekil sekiz, distal kolonda OM ve DSS uygulaması sonucunda oluşan bir tümörün temsili histolojisini göstermektedir. Gösterilen fotomikrograflar H ve E-B-R-D-U ve beta-catenin ile boyanmış olup, insan kolon adenokarsinomlarına benzer displastik değişiklikler sergilemektedir. Bu videoda, tek bir OM enjeksiyonunu takiben üç adet yedi günlük DSS döngüsü kullanarak, farelerde inflamasyon kaynaklı kolonik tümörijenez için bir protokol göstermiş bulunmaktayız.

Bu model, 10 haftalık bir süre boyunca, insanlardaki kolit ilişkili kanserde meydana gelenlere yakından benzeyen histolojik ve moleküler değişikliklere sahip tümörler oluşturur ve bu hastalıkta onkogenez ile kemopreventif çalışmalar için oldukça değerli bir model sunar.