Hücre-invaziv DISC1 Protein Türlerinin Üretimi, Saflaştırılması, ve Karakterizasyonu

Aşağıdaki prosedürlerin genel amacı, alıcı hücreleri istila edebilen saflaştırılmış disk agregatları oluşturmaktır. Bu amaca ulaşmak için iki farklı yöntem sunulacak olup, ilk yöntemle uygulama gösterilecektir.

Somes oluşturan floresan protein disc one füzyon proteini, NLF insan nöroblastoma donör hücrelerinde aşırı ifade edilir. Hücreler daha sonra PBS ile yıkanır, toplanır ve deterjan kullanılmadan lizize edilir. DNA sindirilir ve sükroz gradyan sistemi kullanılarak agro zonlar saflaştırılır.

Bu yöntemle saflaştırılan Agriosların hücre istila verimliliği düşüktür. Alternatif yaklaşım, rekombinant disc one proteininin 5 98 ile 7 85 arasındaki amino asitlerini e coli'de aşırı ifade etmektir. Protein fragmanı daha sonra DITE 5 94 ile işaretlenir,le diyalize edilir ve geri kalan bağlanmamış boyayı ve multimerik disc'i uzaklaştıran bir NI NTA matrisi kullanılarak saflaştırılır.

Bu yöntemle üretilen fragmanlar, konak hücre invazyonunu değerlendirmek için yüksek hücre invazyon verimliliğine sahiptir. Saflaştırılmış floresan protein diski, ribozomlar veya işaretlenmiş rekombinant disk kullanılır. Fragmanlar, ilgilenilen alıcı hücrelerle inkübe edilir.

Ardından, hücre dışı floresanışı söndürmek için Trian blue eklenir ve invazyon konfokal mikroskopi ile görselleştirilir. Şu ana kadar, protein agregasyonu şizofreni gibi kronik mental hastalıkların tanınmış bir özelliği olmamıştır. Şizofrenide bozulmuş olan bir proteinin adayı olduğu durumda, protein agregatlarının hücresel invazivitesi, protein konformasyon hastalıklarının belirgin bir özelliğidir.

Burada, iki yöntemle disc one protein agregatlarının hücre istilacı olduğunu ve dolayısıyla disc one ile ilişkili bozuklukların veya disc one nöropatilerinin protein konformasyonel bozukluklar olduğunu gösteriyoruz. Bu iki yöntemden ilki, nöroblastoma hücre hatlarından tam uzunluktaki disc one ASOS'un saflaştırılması; ikincisi ise, E. coli'de C-terminal multimerik bir disc one fragmanının ekspresyonu ile birlikte saflaştırılması ve floresan boya ile işaretlenmesidir.

İlk yöntemle, saflaştırılmış mikrozomları alan hücrelerin yalnızca %0,3'ü gibi düşük bir hücre istilası verimi elde edilirken, saf rekombinant protein fragmanı maruz kalan hücrelerin %20'sine kadar enfekte etmektedir. Burada açıklanan yöntemlerin, akrozom oluşumunun veya multimerik montajın ikna edici şekilde kanıtlandığı diğer proteinlere de aktarılabilir olması beklenmektedir. Her bir 10 santimetrelik kapta.

1,5 x 10⁶ insan nöroblastoma ve LF hücresini, desteklenmiş RPMI 1640 ortamına ekleyin ve gece boyunca büyütün. Ertesi gün hücreler %70 ila %80 konfluense ulaşmış olmalıdır; beş kabı PC DNA 3.1 MRFP ve EGFP etiketli insan tam uzunluklu disc 1 ile transfeksiyon için, beş kabı ise yalnızca EGFP plazmidi ile transfeksiyon için etiketleyin. Her 10 cm'lik kap için 15 µg plazmid DNA'sını, 30 µL met afekting ve 750 µL'yi birleştirin.

Bir mikro santrifüj tüpündeki Opti MEM, pipetle aşağı yukarı çekilerek karıştırılır ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. Ardından hücreleri transfekte etmek için, DNA transfeksiyon reajanı çözeltisi hücrelerin üzerine damla damla eklenir; hücreler 37 °C'de %5 CO2 ortamında inkübe edilir. Transfeksiyondan 48 saat sonra MRFP tam uzunluklu disc one ekspresyonu izlenmiş ve bir floresan mikroskobu altında aggresom oluşumları doğrulanmıştır. Burada gösterildiği gibi, bazı hücreler yoğun floresan protein inklüzyonları barındırmaktadır.

Bu protokol, beyin dokusundan Lewy cisimcikleri saflaştırma yöntemi ile daha büyük agregatların veya agro bölgelerin izole edilme protokolünü birleştirmektedir; mevcut yöntemler deterjan kullanımına dayalı olduğundan, hücre istilası deneylerinde uygulanmak üzere deterjan içermeyen proteinlerin izole edilmesi kritik önem taşır. Ardından, besiyerini aspire edin, PBS ile yıkayın ve protease inhibitör kokteyli içeren 400 µL PBS ekleyin. Daha sonra hücreleri sıyırın; bir mL hücre süspansiyonunu ve 10 adet seramik boncuğu iki mL'lik bir lizis tüpüne ekleyin.

Hücreleri, pre-cell lyse 24 homojenizatöründe üç adet 62. pulse ile lizleyin. İşlemin mekanik kuvveti, numune içindeki sıcaklığın 37 °C üzerine çıkmasına neden olabilir. Bu nedenle, numunenin buz üzerinde soğutulmasına dikkat edilmelidir. Liz prosedürünün ardından, hücreleri buz üzerinde soğuttuktan sonra, 10 mM magnezyum klorür ve mililitre başına 40 ünite DNAz ekleyin ve 37 °C'de çalkalayarak 60 dakika inkübe edin.

PBS içinde ağırlıkça hacme göre %80, %50 ve %20 oranlarında 10'ar mililitre sakkaroz hazırlayın. Ardından, 15 mililitrelik konik bir tüp içerisinde, önce iki mililitre %80 sakkaroz, ardından iki mililitre %50 ve iki mililitre %20 sakkaroz kullanarak sakkaroz gradyanını hazırlayın. Gradyanı yavaşça dökün ve önceden dökülmüş katmanları bozmamaya dikkat edin.

Sindirilmiş lizatı gradyanın üzerine katmanlayın ve 4 °C'de 1000 ×g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjlemi işlemi bittiğinde, %50 ile %80 sükroz tabakası arasındaki ara yüzeyi bir pipetle dikkatlice toplayın ve 15 mL'lik konik bir santrifüj tüpüne aktarıp beş hacim ile karıştırın; ardından 4 °C'de 1000 ×g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve agri zonu içeren pelleti saklayın.

Bu ara yüzde yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Agri bölgeleri floresan özelliktedir ve son yıkamadan sonra mikroskop altında UV ışığı ile görüntülebilir; süpernatantı atın ve peleti 250 ila 500 microliters PBS içinde yeniden süspande edin. Bu pelet, saflaştırılmış agro bölgeleri içerir.

Steril cam lameller üzerinde çözünür GFP disc1 C-terminusunu konstitütif olarak eksprese eden SH-SY5Y insan nöroblastoma hücreleri içeren 24 kuyucuklu bir plağın her kuyucuğuna 10 µL MRFP disc1 asome süspansiyonu ekleyin. İnkübasyonu 48 ila 72 saat boyunca sürdürün. İnkübasyonun ardından hücreleri üç kez PBS ile yıkayın ve hücre dışı floresanışı 0,04% trypan blue ile beş dakika boyunca söndürün.

Ardından, triyan mavisini uzaklaştırmak için PBS ile yıkayın. Sonra, kabı buza yerleştirin ve hücreleri sabitlemek için 10 dakika boyunca %4 PFA ve PBS ekleyin. Daha sonra steril su ile bir kez yıkayın ve lamelleri, DPI montaj medyumu içeren prolonged gold ile cam lamlar üzerine monte edin.

Z-yığın görüntülerinde, alıcı hücreler tarafından eksprese edilen ve bölgeye çekilen proteinlerle kolokalizasyon yoluyla, dışarıdan uygulanan agrezonların istila sırasındaki alımını doğrulayın. Bu Z-yığın yaklaşık altı mikrometre derinliği kapsar.

200 nanometre adımlarla çekilmiş 24 görüntü. Kırmızıyla gösterilen MRFP disk bir agri zonu floresansı,le görülmekte oluple sitozolik GFPC terminal diskini toplar. Yeşil ile gösterilen bir fragmanyla kolokalizasyon sarı olarak görülür ve agri zonlarının alıcı sitozole girdiğini ve önceden çözünür durumda olan disk bir proteinini topladığını gösterir.

Protokolün bu bölümünde, human disc one, DITE 5 94 ile işaretlenecektir. Bu D, ek immün boyama gereksinimi olmadan rekombinant proteinin doğrudan izlenmesini sağlar. Eşlik eden belgede açıklanan şekilde hazırlanan proteinin, 1/2000 dilüsyonda iki litre PBS içinde üç kez diyalize edilerek beta-merkaptoetanolden arındırılmasıyla işleme başlayın.

Bir miligramlık disk bir'i DITE 5 94 IDE ile etiketleyin; mililitre başına bir miligram proteini PBS içinde çözün ve serbest TH gruplarını geri kazanmak için beş milimolar TCEP ekleyin. Reaksiyona DMF içinde çözünmüş boyadan 20 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. 10.000 Dalton moleküler ağırlık kesme sınırına sahip bir SLI diyaliz kaseti kullanarak, proteini PBS içinde 1:2000 oranında, her biri iki saat sürecek şekilde üç kez diyalize edin. Ardından, etiketlenmiş proteinin saflığını daha da artırmak için işlemi tekrarlayın.

Ni-NTA kolonunda histidin etiketi (his tag) tabanlı bir afinite saflaştırması gerçekleştirilir. Bir mililitre Ni-NTA matrisi, 10 mililitre PBS ile yıkanır; ardından etiketlenmiş ve diyalize edilmiş protein kolona uygulanır ve kolon üzerinden akmaya bırakılır.

Proteinin NTA matrisine bağlanması nedeniyle çözelti yavaşça mavi renginin bir kısmını kaybedecek ve işaretlenmemiş serbest boya akış sırasında kalacaktır. Protein çözeltisi kolona girdikten sonra, kolonu üç kez 20 milliliters PBS ile yıkayın; proteini elüye etmek için kolona 500 millimolar imidazole içeren iki milliliters PBS ekleyin.

Valfi düşük hıza ayarlayın ve Ni-NTA kolonundaki renkli bandı izleyerek damla damla elüsyon yapın. Elüatın bu renkli fraksiyonu işaretlenmiş rekombinant protein içerir; elüatı bir SLI diyaliz kasetine aktarın ve 2 litre hacimdeki 10 millimolar NAPI içerisinde 1:2000 dilüsyonla, her biri iki saat sürecek şekilde üç kez diyalize edin. Diyaliz sonrası elüatı steril 0.45 mikrometre şırınga filtresinden geçirin, ardından beş adet 100 microliter örneğe ayırarak sıvı azot içerisinde şok dondurun.

Her 100 µL'lik alikvotta toplam protein miktarı 0,5 ile 1 µg/mL arasında olmalıdır. Proteinin invaziv kapasitesini değerlendirmek için, steril cam lameller üzerinde çözünür GFP etiketli Disc1 C-terminus'u sürekli olarak eksprese eden alıcı SH SY 5Y insan nöroblastoma hücrelerini içeren 24 kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa, 5 ile 10 µg/mL etiketli rekombinant Disc1 proteini içeren besiyeri ekleyin ve 48 ile 72 saat boyunca inkübe edin.

Hücre dışı floresansı söndürün ve agri zonu ile işlem görmüş hücrelerde olduğu gibi hücreleri fikse edip mount edin; eksojen olarak uygulanan rekombinant proteinin invazyonunu Z-stack görüntüleme ile doğrulayın. İşaretli protein hücre içine alındığında, konfokal mikroskopi ile oluşturulan görüntülerde alıcı hücrelerin çevresi içerisinde tespit edilir. Bu Z-stack, 220 nanometre'lik 24 adımda yaklaşık beş mikrometre derinliği kapsar.

Burada, kırmızıyla gösterilen rekombinant disc one fragman 5 98 ile 7 85, çözünür C-terminal GFP etiketli disc one'in (yeşil ile gösterilen) eksprese edildiği alıcı hücreler tarafından alınarak disc protein agregatlarının invazivliği belirlenmektedir. MRFP etiketli tam uzunluktaki disc one'den oluşan akrozom bölgeleri NLF hücrelerinden saflaştırılmış ve burada gösterildiği üzere bu protokole uygun olarak alıcı SH SY five Y hücrelerine uygulanmıştır. A-M-R-F-P etiketli disc one akrozomu, çözünür GFP etiketli C-terminal disc one eksprese eden bir insan nöroblastoma SH SY five Y hücresini invaze etmiştir.

Ayrıca, MRFP etiketli disc one asome, çözünür GFP etiketli disc one'i çözünmez agregatlar içine çekebilmiştir; DIA light işaretli rekombinant disc one'in invazivliğini belirlemek için, burada gösterildiği gibi, çözünür GFP disc one eksprese eden SH SY five Y nöroblastoma hücrelerine uygulanmıştır. Kırmızı ile gösterilen rekombinant disc one protein kümeleri alıcı hücreye invaze olmuştur; sarı noktalar, çözünür GFP etiketli C-terminal disc one'in agregatlar içine çekildiğini göstermektedir. E coli'den eksprese edilen ve saflaştırılan işaretli rekombinant disc one, multimerik protein bir sıçanın medial prefrontal korteksine stereotaktik olarak enjekte edildiğinde in vivo olarak nöronlar için de hücre invaziv özelliği göstermiştir. Z-stack görüntüleme, nöronal çekirdeklere karşı bir antikorla boyanmış sıçan kortikal nöronunda rekombinant disc one proteininin varlığını doğrulamaktadır.

Hücre invazyonunu incelemek için disc one agregatları oluşturmaya yönelik iki yöntem göstermiş olduk. Bu yöntemlerden herhangi birini kullanarak, yabancı DNA transfeksiyonu yoluyla rekombinant gen ekspresyonunun neden olabileceği karıştırıcı değişkenler olmaksızın, disc one agregatlarının alınmasının hücresel etkilerini araştırabiliriz. Bu teknikler, disc one protein patolojisinin biyolojik etkilerini in vitro olarak hücrelerde ve in vivo olarak hayvan modellerinde intraserebral inokülasyon veya diğer uygulama yöntemleriyle incelemek için uygulanabilir.

Bu tekniklerin, her bir proteine özel olarak uyarlanmış protokollerde yapılacak küçük modifikasyonlarla, zamanla diğer protein agregatlarına da aktarılabileceğine inanıyoruz. Bu prosedürü uygularken, konfokal mikroskopi görüntülerinin titizlikle analiz edilmesi için yeterli zaman ayırdığınızdan emin olun.