Zebra balığı Geliştirme Sırasında Photoconvertible Proteinler kullanma Cep Takip

Bu prosedürün genel amacı, canlı bir zebra balığı embriyosunda foto-anahtarlamalı hücreleri takip etmektir. Bu işlem, öncelikle bir embriyonun düşük erime sıcaklıklı agar içine gömülmesi ve dokuya özgü bir foto-konvertibl floresan proteinin eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, ilgi bölgesindeki protein tamamen foto-konverte edilir.

Ardından embriyo dikkatlice agarozdan çıkarılır ve sonraki aşamalara kadar 28,5 °C sıcaklıktaki yumurta suyunda muhafaza edilir. Son olarak, fotokonvert edilmiş embriyo tekrar düşük erime sıcaklıklı agaroza gömülür. Nihayetinde, konfokal mikroskopi aracılığıyla, fotokonvert edilmiş proteinin stabil varlığı sayesinde fotokonvert edilmiş hücrelerin sonraki aşamalarda kesin olarak tespit edilebildiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bugün sunacağımız yöntemin hücre ve gelişim biyolojisi bağlamında oldukça faydalı olacağını düşünüyoruz. Bu metodolojinin hücre göçü, doku dinamikleri ve diğer hücre davranışları bağlamında kullanılmasının oldukça yararlı olacağı kanısındayız. Prosedürü, foto-konvertibıl floresan protein ekspres eden transgenik zebra balıklarını çaprazladıktan sonra laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Veronica Lombardo uygulamalı olarak gösterecektir.

Homozigot olan en parlak embriyoları seçin ve istedikleri evreye ulaştıklarında 28,5 °C'de büyütün. Embriyoları anesteziye almak için yumurta suyu içeren cam bir kap içerisinde pens yardımıyla koroiyon zarlarını soyun. Embriyoları teker teker trica içerisine aktarmak için cam bir pipet veya kesilmiş bir pipet ucu kullanın.

Anestezize edilmiş embriyoyu bir kültür kabının kapağına aktarın ve embriyoyu mümkün olan en küçük besiyeri hacmi içinde tutun. Embriyoyu, 30 °C'de %1 düşük erime sıcaklıklı, trica içeren agros ile pipetleyerek agros içine aktarın ve lam tabanlı bir kültür kabına yerleştirin. Agros polimerize olduğunda embriyoyu yönlendirmek için düz bir plastik uç kullanın.

405, 488 ve 561 nanometre lazer kaynakları ile 20 x objektife sahip ters konfokal mikroskop altında Trica çözeltisi ile örtün. İlgi bölgesini de içeren numunenin tüm yapısının Z yığınına (Z stack) sahip olmak için 488 ve 561 nanometre lazerleri kullanın. Zaman serisi aracını seçin ve foto konversiyon öncesi ve sonrası için birer adet olmak üzere, ara süre bırakmadan iki döngü şeklinde ayarlayın.

Bölge aracını seçin ve foto dönüştürme için bir veya daha fazla ilgi alanı belirleyin. Ardından, ağartma aracını seçin ve taramadan sonra ağartmayı başlat seçeneğini ayarlayın. Burada kullanılan iki lazerden biri 30 milliwatt 405 nanometre diyot lazerdir.

Lazer ışığının şiddeti, ilgilenilen bölgenin tarama tekrarları ve tarama hızı değiştirilerek, tam fotokonversiyon için gerekli olan minimum lazer ışığı miktarı için dikkatlice optimize edilir. Foto-konvertibl floresan proteinin kalan yeşil ve fotokonvertiyona uğramış kırmızı floresansını görselleştirmek için örneği 488 nanometre ve 561 nanometre lazerlerle tarayın. Fotokonversiyon işleminden sonra çözeltiyi boşaltın ve bir iğne veya pürüzsüz plastik uç kullanarak embriyoyu agarozdan dikkatlice çıkarın.

Embriyoyu, istenen gelişim aşamasına gelene kadar karanlıkta, 28,5 °C sıcaklıktaki yumurta suyunda tutun. Embriyoyu ikinci kez gömün, ardından 488 ve 561 nanometre lazerlerini kullanarak ilgi bölgesini de içerecek şekilde örneğin bir Z-yığını (Zack) oluşturun. Bu protokol normal gelişimi etkilemediği için, fotokonverte edilmiş embriyoyu daha sonraki aşamalarda gözlemlemek mümkündür.

İşte bir fotokonversiyon analiz örneği. Endotel hücreleri, burada gösterildiği gibi endotel çekirdeklerinde kick G eksprese eden transgenik bir raporlayıcı hat kullanılarak, döllenmeden sonraki 48 ile 72 saat arasındaki zebrafish gelişimi sırasında takip edilmiştir. Fotokonversiyondan önce kick G, endotel doku içinde eksprese edilmişti ve 488 nanometrelik bir argon lazeri kullanılarak yalnızca yeşil floresan olarak tespit edilebiliyordu; kırmızı floresan için 561 nanometrelik lazerle yapılan kontrol taramalarında, fotokonversiyon öncesinde herhangi bir fotokonverte kick GR tespit edilmemiştir.

Ardından, ilgi alanı 405 nanometre diyot lazer kullanılarak %10 yoğunlukta ve 20 yinelemeyle tamamen fotokonvert edildi ve kafa damarları 488 nanometre ve 561 nanometre lazerler kullanılarak tekrar tarandı. Bu panelde, fotokonvert edilen endotel hücrelerini daha sonraki aşamalarda takip edebilmek için ilgi alanı içindeki yeşil kick G tamamen kırmızıya dönüştü. Embriyo, fotokonversiyondan 24 saat sonra, yani fotokonvert edilen ilgi alanından köken alan endotel dokular içinde döllenmeden yaklaşık 72 saat sonra gözlemlendi.

Kırmızı floresan foto-dönüştürülmüş kick G proteinlerinin stabilitesi ve ardından yeni yeşil dönüştürülmemiş kick G proteinlerinin sentezlenmesi nedeniyle, hem dönüştürülmemiş hem de foto-dönüştürülmüş kick G proteinleri gözlemlenmiştir. Bu teknik, gelişim biyolojisi alanındaki araştırmacıların çeşitli balıklarda hücre biyolojisini ve doku yeniden şekillenmesini incelemelerinin önünü açmıştır.