3DNA ile Nükleik Asit Yapıları analiz ve Yapı

Bu prosedürün genel amacı, laboratuvar bilimcilerinin ve diğer araştırmacıların DNA ve RNA uzaysal organizasyonunu son teknoloji hesaplama araçlarıyla inceleyebilmeleri için 3D NA program paketini onlara sunmaktır. Bu işlem, öncelikle yazılımın 3D NA forumundan indirilmesi ve yerel bir bilgisayara kurulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, temsilci bir DNA yapısının, onu oluşturan baz çift basamakları düzeyinde analiz edilmesidir.

Ardından, aynı DNA yapısı baz çift basamağı düzeyinde modifiye edilir ve daha sonra yeni tanımlanan baz çift basamağı parametreleri kullanılarak yeniden oluşturulur. Sonraki adım, ilgili yapılardan oluşan geniş bir topluluğun analiz edilmesidir. Son adım ise, yapıların genel distorsiyonlarını görselleştirmek amacıyla, ilgili bir dizi DNA yapısının ortak bir referans çerçevesinde hizalanmasıdır.

Nihayetinde, 3D NA araçları; ilaçlara ve proteinlere bağlı olanlar da dahil olmak üzere, bireysel baz çifti basamaklarının DNA'nın genel katlanmasına nasıl katkıda bulunduğunu incelemek ve önemli boyutlardaki küresel bozulmaların bölgelerini ve yönlerini belirlemek için kullanılır. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, yazılımın sağlam olması ve çeşitli nükleik asit içeren yapılara yaygın olarak uygulanabilmesidir. Bu yöntem; genomların üç boyutta nasıl organize olduğu ve DNA'nın ne tür deformasyonlar geliştirebileceği gibi biyokimya ve biyofizikteki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Yazılım paketinin kurulumuna başlamak için, three DA web sitesine@xthreed. org bağlanın ve 3D NA forumu bağlantısına tıklayın. Forum içerisinde, kayıt ol bağlantısını seçin ve yeni bir hesap oluşturmak için talimatları izleyin.

Kullanıcı adı ve şifre oluşturulduktan sonra forumda oturum açın, karşılama bölümündeki indirmeler bağlantısını seçin ve yeni sayfada 3D NA download seçeneğini belirleyin. 3D NA yazılımını içeren X 3D NA dash V 2.1 adlı bir klasör oluşturmak için tar gz dosyasına çift tıklayın. Macintosh bilgisayarlarda genellikle araçlar altında bulunan terminal uygulamasını açın ve X 3D NA dash V 2.1 dizinine geçiş yapın.

3D NA'nın düzgün çalışması için gerekli olan kurulum betiğini çalıştırın. Bu videoda kullanılan tüm komutlar metin protokolünde bulunabilir. Ardından, ekranda yazılı olarak görünen iki satırlık dışa aktarma ayarlarını kopyalayın.

Kullanıcı yazılımı uygulamalar dizinine yerleştirdiyse, iki satır burada gösterildiği gibi görünmelidir. Uygulamalar dizininde bulunan metin düzenleme uygulamasını açın. Biçim menüsü altından, Düz metin yap seçeneğini belirleyin.

Eğer bir .bashrc dosyası mevcutsa, dosyayı metin düzenleyici ile açın, düzenleyin ve dışa aktarma ayarlarını dosyanın sonuna yapıştırın. Eğer bir .bashrc dosyası mevcut değilse, dışa aktarma ayarlarını boş bir dosyaya yapıştırın ve ana dizine .bashrc adıyla kaydedin. Yeni ayarların aktif hale gelmesi için, yeni kaydedilen .bashrc dosyasını terminal programı içerisinde çalıştırın.

Bu video, Borrelia bergdorfii bakterisinden HBB proteinine bağlı DNA örneği üzerinden temsili bir nükleik asit yapısının analizini göstermektedir. 3D NA analizindeki ilk adım, tüm eşleşmiş bazları listeleyen bir dosyanın oluşturulmasıdır. Bu işlem, NP2MP2.pdb dosyasında saklanan atomik yapıya Find para programını uygulamak için bir komut yazılarak gerçekleştirilir.

Analizdeki bir sonraki adım, yapıyı karakterize eden geometrik parametrelerin belirlenmesidir. analyze komutu, girdi olarak baz çifti dosyasını alır ve çalışma dizininde görünen birkaç çıktı dosyası oluşturur. Geometrik değerler daha sonra analyze two MP two bps yazılarak hesaplanabilir.

Oluşturulan çıktı dosyaları, hesaplanan parametrelerin genel bir görünümünü içeren iki MP two out ile rijit gövde parametrelerinin bir listesini içeren bpco step par dosyalarını içerir; bir nükleik asit yapısının analizine ek olarak, 3D NA yazılımı, hem omurga hem de baz atomları için koordinatlar içeren yaklaşık bir atomik model oluşturmak amacıyla, rebuild komutunu kullanarak rijit gövde parametrelerinden yapısal bir model oluşturma yeteneği sunar. Metinde listelenen komutu yazın. Bu komut, 3D NA'ya rijit gövde parametrelerinden modeller oluştururken standart bir BDNA omurga konformasyonu eklemesini talimatlandırır.

H-B-B-D-N-A yapısında bulunan katı cisim parametrelerine sahip çift heliksli bir model, uygun komut yazılarak oluşturulabilir. Modifiye edilmiş bir yapı üretmek için bpco step par dosyası düzenlenebilir. Burada, en yüksek bükülmenin gerçekleştiği iki bölgede oluşan uç roll açıları modifiye edilmiştir.

Ardından, yapı, girdi dosyası olarak modifiye edilmiş adım parametreleri seti ile oluşturulur. İki model, tek bir nükleik asit içeren yapının analizinin aksine, standart bir moleküler görüntüleyici ile incelenebilir. Videonun bu bölümü, isimleri MD_set1.pdb ile başlayıp bir numara ile biten bir dizi dosya içerisindeki geniş bir yapı topluluğunun nasıl analiz edileceğini gösterecektir.

Analizdeki ilk adım, daha önce yapıldığı gibi find pair programı çalıştırılarak eşleşmiş bazların tanımlanmasıdır; tüm yapı seti aynı baz eşleşme şemasını paylaştığı için, burada temsilci bir dosya olan 1001 ile biten dosya üzerinde find pair programının bir kez çalıştırılması gerekir. Bu işlem, baz eşleşme bilgilerini oluşturur ve bunları MD at set one BPS PS dosyasında saklar. Bir sonraki adımda, Command X 3D ncore ensemble.Analyze komutu kullanılarak tüm yapı setinin geometrik parametreleri belirlenir. Ardından, istenen rijit gövde parametreleri genel çıktı dosyası olan MD at set one out dosyasından çıkarılabilir.

Bu işlem Command X three DCO ensemble extract kullanılarak gerçekleştirilir. Yuvarlanma açıları çıkarılır ve bu açıların yer aldığı, virgülle ayrılmış bir metin dosyası oluşturulur. Bu dosya, daha ileri analizler ve grafik çizimleri için diğer programlara aktarılabilir.

3D NA'nın en güncel sürümü, kullanıcının birden fazla yapıyı ortak bir perspektiften incelemesine olanak tanıyan yeni bir özelliğe sahiptir. X three DCO ensemble reorient komutu, önceki protokollerde olduğu gibi, ilişkili yapı koleksiyonunu ortak bir baz çifti veya baz çifti basamağı üzerinde üst üste getirir. İlk adım, find pair programı ile DNA'nın baz eşleşmesini hesaplamaktır.

Bu durumda, giriş dosyası, CIA coli'nin 10 yapısını içeren iki KEK pdb dosyası ile LAC Represör proteininin baş kısmına bağlanmış O 3D NA operatörüdür. Command X three DCO ensemble reorient komutu, çok modelli bir yapıdaki münferit modelleri ortak bir referans çerçevesine hizalayacaktır. Bu komut, giriş olarak hem PDB dosyasını hem de önceki adımdan elde edilen baz eşleşme dosyasını gerektirir.

Komuta ayrıca, tüm yapıların hizalandığı baz çifti basamağının kimliği de dahil edilmiştir. W 3D NA web arayüzü, 3D NA yazılım paketinin bazı popüler özelliklerini içermektedir. Videonun bu bölümü, web sunucusu ile proteinle dekore edilmiş DNA'nın üç boyutlu modellerini oluşturma yeteneğine dikkat çekmektedir.

Proteinle dekore edilmiş bir DNA modeli oluşturmadaki ilk adım, W three d.rutgers.edu adresinde bulunan W 3D NA web sitesini ziyaret etmektir. Sayfanın sol üst köşesindeki menüden reconstruction seçeneğinin belirlenmesi, çevrimiçi model oluşturma özelliklerini etkinleştirir. Bir sonraki adım, yeni sayfanın ortasındaki hafif gölgeli kutuda bulunan bound protein DNA template bağlantısını seçmektir.

Bu seçim, kullanıcının bağlı protein sayısını belirlemesine olanak tanıyan bir açılır menüyü etkinleştirecektir. Bağlı protein sayısının seçilmesi, yeni bir belirleme sayfasına yönlendirir. Kullanıcı daha sonra istenen diziyi yazabilir veya yapıştırabilir.

Yeni sayfanın ortasındaki metin kutusunda, DNA'nın bağlanmamış bölgelerinin heliks konformasyonunu seçmek için metin kutusunun altında bir açılır menü bulunmaktadır. Belirtim sayfasının alt kısmına yakın, bağlanan proteinlerin bağlanma konumlarını ve dosya adlarını girmek için bir metin kutusu yer alır. Bağlanma konumu, DNA dizisi üzerindeki bağlanan protein fragmanının merkezinin konumunu belirtir.

Spesifikasyon sayfasının altında, kullanıcının proteine bağlı DNA'nın bir önizlemesini oluşturmasına olanak tanıyan bir kutucuk bulunmaktadır. Bu durumda, söz konusu kutucuk işaretlenir ve devam et düğmesine tıklanır. Bu işlem, seçilen parametreleri ve seçilen bağlanma bölgelerinin çakışmasından kaynaklanabilecek hataları listeleyen bir gözden geçirme sayfası oluşturur.

Herhangi bir değişiklik yapılması gerekiyorsa kullanıcı geri butonunu, devam etmek için ise oluştur butonu seçebilir. Bir sonraki sayfa, DNA protein kompleksinin en genişlemiş düzenlemesinin statik bir görüntüsünü görüntüler ve web üzerinden çevrimiçi etkileşimli görselleştirme imkanı sunar. Kullanıcı ayrıca atomik koordinatları içeren bir dosyayı indirebilir.

Nükleik asit yapılarını analiz etmek için 3D NA yazılım araçları rutin olarak kullanılır. Rijit gövde parametrelerinin değerleri, üç boyutlu yapıdaki bozulmaları ortaya koyar; örneğin, 13. ve 22. basamaklarda bulunan büyük pozitif roll açılarıyla birlikte DNA'nın majör oluğa doğru aşırı büküldüğü iki bölge gibi. Bu durum, DNA'nın Borrelia Bergdorf, RHBB proteini ile olan kristal kompleksinde gözlemlenmiştir.

Yazılımın yapıları bu niceliklerden yeniden oluşturma yeteneği, tekil bazların ve baz çifti adımlarının genel moleküler katlanmaya nasıl katkıda bulunduğunun belirlenmesini mümkün kılar. Burada gösterildiği üzere, HBB tarafından indüklenen DNA'nın genel bükülmesi, yukarıda belirtilen iki uç rol distorsiyonundan daha fazlasını yansıtmaktadır. Bu baz çifti adımları düzleştirilerek yeniden yapılandırıldığında, DNA yüksek derecede kıvrımlı kalmaya devam eder.

Bu durum, rolün en büyük iki değerinin sıfıra ayarlandığı andır. 3D NA'nın çok sayıda ilişkili yapıyı incelemeye olanak tanıyan yeni yeteneği, simüle edilmiş DNA ve RNA moleküllerinin uzaysal düzenlemelerindeki hem diziden hem de zamandan bağımlı kalıpların çıkarılmasını mümkün kılar. Örneğin, simüle edilmiş iki büyük DNA yapı seti içindeki ardışık baz çiftleri arasındaki roll açılarının sarı renkli kaplaması, bu moleküllerin Permian purin baz çifti basamaklarında öncelikli olarak büküldüğünü ortaya koymaktadır.

DNA uçlarında kısa sürelerle devam eden ve kırmızıyla gösterilen daha yüksek roll değerleri, çift heliks yapısının yerelleştirilmiş erime ve yeniden kapanmasının olduğuna işaret etmektedir. Komplementer bazlar arasındaki açılar ve mesafeler gibi diğer rijit gövde parametrelerinin varyasyonel modelleri, kesin yapısal bozulmaları çözmeye yardımcı olabilir. 3D NA yazılımının ilgili molekülleri ortak bir referans çerçevesinde yeniden yönlendirme yeteneği, protein veri bankasında saklanan birçok dosyada gizli olan genel yapı özelliklerini ortaya çıkarmaktadır.

Örneğin, karşılıklı atomların ortalama karekök uyumu (root mean square fit) temelinde ilgili yapıların geleneksel hizalaması, burada birbiri üzerine kabaca binen bir dizi benzer uzaysal yol üretmektedir; bunlar, Escherichia coli O3D NA operatörünün LAC represör proteininin baş kısımlarına bağlı olduğu 10 NMR tabanlı modeldir. Aynı yapıların ortak bir koordinat sisteminde, her dupleksin beş prime terminal baz çifti üzerinden üst üste getirilmesi, moleküllerin belirgin şekilde farklı yönlerde esnediği küresel yapıda önemli distorsiyonlar olduğunu ortaya koymaktadır. Yapısal değişkenlik, Escherichia coli LAC represör proteininin O3'e bağlanma kolaylığını ve LAC operonundaki O3 ile sıralı olarak uzak operatörler arasında bir halka (loop) oluşturmasını etkileyebilir. Burada gösterildiği gibi, Borrelia burgdorferi kaynaklı HBB gibi mimari bir proteinin hassas yerleşimi, DNA'nın genel katlanması üzerinde dramatik bir etkiye sahip olabilir.

Bilinen yüksek çözünürlüklü yapının iki kopyası 43 baz çifti ile ayrılmışsa, 81 baz çiftlik bir DNA fragmanı sık, neredeyse dairesel bir konfigürasyonla kapanır. Eğer iki protein ek beş baz çifti ile ayrılmışsa, DNA açık ve kıvrımlı bir yol izler. Proteinlerle süslenmiş dubleksin birbirinden çok farklı olan bu düzenlemeleri, mimari proteinlerin aralıklarının, DNA'nın gelişimi sonrası siklizasyonunu veya döngü oluşumunu nasıl etkileyebileceğini göstermektedir.

Bu teknik, nükleik asit yapısal biyolojisi alanındaki araştırmacıların; gelişimsel kusurları ve kanser gibi hastalıkları daha iyi anlamak ve yeni terapötikler tasarlamak amacıyla DNA-protein etkileşimlerini, RNA'yı, katlanmayı ve nanoparçacık tasarımını keşfetmelerinin yolunu açmıştır.