Elektrik-Free, Sıralı Nükleik Asit ve Protein İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, elektrik veya laboratuvar altyapısına ihtiyaç duymadan bir örnekten PCR'a hazır nükleik asitleri ve immünoreaktif proteini izole etmektir. Nükleik asitlerin ve proteinlerin izolasyonu, örneği liz etmek için guanidin ve tiyosiyanat ile karıştırmakla ve ardından karışımı ekstraksiyon pipetindeki sorbent üzerinden geçirmekle başlar. Sorbent üzerinden beşinci ve son geçişten sonra, immünoreaktif proteini izole etmek için karışımı protein ekstraksiyon tamponuna aktarın ve bekletin.

Ardından, sorbent üzerinden %95 etanol geçirilerek sorbent ve bağlı nükleik asitler yıkanır. Daha sonra, sorbent üzerinden beş dakika boyunca ortam havası geçirilerek sorbent ve bağlı nükleik asitler birçok kez kurutulur. PCR'a hazır nükleik asit izolasyonunun son adımı, immünoreaktif proteinin izolasyonu için 250 µL tris veya benzeri başka bir sulu çözelti kullanarak nükleik asitleri sorbentten ayırmaktır.

Numune ve protein ekstraksiyon tamponu karıştırıldıktan sonra, ikinci bir ekstraksiyon pipeti kullanarak karışımı sorbent üzerinden 15 kez geçirin. Bir sonraki adım, %95 etanolü sorbent üzerinden birçok kez geçirerek bağlanan proteinle birlikte sorbenti yıkamaktır. Ardından, beş dakika boyunca sorbent üzerinden ortam havası geçirilerek sorbent ve bağlanan protein kurutulur.

Protokolün son adımı, proteini sorbentten elüye etmektir. Nihayetinde, bu prosedürde kullanılan ekstraksiyon pipeti, PCR'a hazır nükleik asitlerin ve immünoreaktif proteinin elektrik gerektirmeden izolasyonuna olanak tanır. Merhaba, benim adım Dave Pawlowski.

Buffalo, New York'taki Kubrick Incorporated şirketinde kıdemli araştırma bilimcisiyim ve bugün, örnek lizi öncesinde santrifüj, vorteks veya başka herhangi bir harici laboratuvar ekipmanına ihtiyaç duymadan, hem proteini hem de nükleik asitleri sıralı olarak izole edecek bir tekniği öğreneceğiz. Örneklerin sıvı formda olduğundan emin olun. Örnek katı ise, örneğin gıda veya dışkı ise, örnek su veya fosfat tamponlu salin gibi sıvı bir besiyerine süspande edilmelidir.

1,5 mililitrelik bir tüp içerisinde 500 µL örneği 500 µL altı molar guandin tiyosiyanat ile karıştırın. Ardından, bir ekstraksiyon pipetinin haznesini bastırarak ortamdaki havayı tahliye edin. Haznenin yavaşça genişlemesini sağlayarak bir mililitrelik örneğin tamamını emici materyal üzerinden ekstraksiyon pipetine çekin.

Sorbent boncukların ve numunenin hazneye boşalmasını sağlamak için ekstraksiyon aracını ters çevirin. Hazne içerisindeki sorbent boncukları numune ile birlikte öğütün. Bu sırada numunenin ekstraksiyon pipetinden dışarı çıkmamasına dikkat edin.

Ekstraksiyon pipetini ters çevirin ve örneği orijinal 1,5 mililitrelik tüpe boşaltın. Bir mililitrelik örneğin tamamını, orta hızda sorbent üzerinden geçirerek ekstraksiyon pipetine çekin. Sorbentin ekstraksiyon pipetinin boyun kısmında kaldığından emin olarak, pompayı sıkarak örneğin tamamını 1,5 mililitrelik tüpe boşaltın.

Numuneyi sorbent üzerinden dört kez daha geçirerek toplamda beş geçiş yapacak şekilde bu işlemi tekrarlayın. Sorbent üzerinden beşinci geçişten sonra, bir mililitrelik numunenin tamamını 15 mililitrelik konik bir tüp içindeki dört mililitre protein ekstraksiyon tamponuna boşaltın. Tüpü ters çevirerek karıştırın, ardından tüpü kapatın ve daha sonraki kullanım için kenara ayırın.

Sorbent üzerinden üç kez bir mililitre %95 etanol geçirerek izole edilen nükleik asitleri yıkayın ve etanolü orijinal tüpüne geri aktarın. Son geçişten sonra, ikinci bir mililitre %95 etanol yıkama solüsyonu kullanarak yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. Prosedürün bir sonraki adımı sorbenti kurutmaktır; nükleik asit geri kazanımı sorbent kuruyken en iyi şekilde gerçekleştirilir.

Bu adımın sıkıcı olduğunun farkındayım. Ancak, bu adımı önerilen süre içerisinde tamamlarsanız sonuçlarınız daha iyi olacaktır. Pompayı beş dakika boyunca bastırıp bırakın.

Nükleik asitleri ve sorbent yatağını kurutmak için ekstraksiyon pipetinden ortam havası geçirin, ekstraksiyon pipetinin ucundaki kalıntı etanolü silin. Bir Kim wipe kullanarak, sorbent üzerinden beş kez 250 µL 10 mM tris geçirerek nükleik asitleri geri kazanın. Tris tamponu, PBS gibi uygun herhangi bir başka sulu çözelti ile değiştirilebilir.

Elde edilen çözelti, ekstrakte edilmiş nükleik asitleri içerir; protein ekstraksiyonunu öncelikle gerçekleştirmek için, örneği, önceden ayrılmış olan protein ekstraksiyon tamponu ile tüpü ters çevirerek karıştırın, bu 5 mL örneğin yaklaşık iki ila üç mililitresini yeni bir ekstraksiyon pipetinin sorbentinin üzerinden geçirin. Tüm örneği aynı 15 mL'lik konik tüpe boşaltın. Bu esnada sorbentin ekstraksiyon pipetinin boyun kısmında kalmasına dikkat edin.

Bu işlemi tekrarlayın. Numuneyi sorbent üzerinden 15 kez geçirin. Sorbent yatağı üzerinden üç kez bir mililitre %95 Ethanol geçirerek sorbenti ve bağlanan proteini yıkayın, etanolü orijinal tüpüne boşaltın; ardından ikinci bir mililitre %95 ethanol yıkama çözeltisi kullanarak üç kez daha yıkayın.

Prosedürün bir sonraki adımı, sorbentin tekrar kurutulmasıdır. Nükleik asitlerde olduğu gibi, protein geri kazanımı sorbent daha uzun süre kurutulduğunda en iyi şekilde gerçekleştirilir.

Ortam havasını ekstraksiyon pipeti boyunca geçirmek için pompayı beş dakika boyunca basıp bırakın. Protein sorbent yatağını kurutmak için, ekstraksiyon pipetinin ucundaki kalıntı etanolü silin. Kim wipe kullanarak, sorbent üzerinden beş kez 250 microliters PBS geçirerek proteini geri kazanın.

PBS tamponu, 10 milimolar tris, pH 6,8 gibi uygun herhangi bir başka sulu çözelti ile değiştirilebilir. Elde edilen çözelti, numunenin protein içeriğini barındırır. Enterohemorajik E. coli O157:H7 suşu EDL933 ile ilişkili shiga toksin genleri, ekstraksiyon pipeti kullanılarak gerçekleştirilen bir nükleik asit protein ekstraksiyon prosedürü ile amplifiye edilmiştir.

Shiga toksini genleri olan shiga toksini bir ve shiga toksini iki, PR promoterinin kontrolü altında, temperat lambda benzeri bakteriyofajlarda ve defektif bakteriyofajlarda bulunur. E. coli'de SOS yanıtının aktivasyonu, profaj indüksiyonuna ve/veya toksin üretimine yol açar. Bu durumda, SOS yanıtı mitomisin C ile indüklemede, tedavi edilmemiş kontrolle karşılaştırıldığında shiga toksini iki geninin amplifikasyonunda büyük bir artış meydana gelir.

Bu durum, pro-faj indüksiyonu ve faj genom replikasyonuna işaret etmektedir. Videoda açıklanan nükleik asit protein izolasyon deneylerinden geri kazanılan protein immünoreaktiftir. İzole edilen protein fraksiyonu, rapid check e coli O 1 57 lateral akış analiz şeritlerine uygulanmıştır.

Kontroller, iki kırmızı bandın varlığıyla görselleştirildiği üzere, Shiga toksini indüksiyonu olan veya olmayan tüm E. coli O157 taşıyan örneklerde pozitif tanımlama göstermektedir. Veriler ayrıca, nükleik asit ve protein için ekstraksiyon pipeti kullanılarak işlenen E. coli O157 taşıyan örnekler için de pozitif sonuçlar göstermektedir. Bu veriler, her bir örnekten izole edilen proteinin immünaktif olduğunu ve böylece pozitif bir yanıtı tetiklediğini göstermektedir.

İzole edilen protein, altı molar gudina izotiyosiyanattan izole edilen BSA ile yüklenmiş ve kumasi ile boyanmış %8'lik akrilamid jelinde burada gösterildiği gibi elektroforez için uygundur. Ekstraksiyon, pipetleme ve ilgili protokol kullanıldığında, izole edilen proteinin elektroforetik hareketliliği kontrol örneklerininkiyle aynıdır. Bu teknikte uzmanlaştığınızda, işlemi 20 dakikadan kısa sürede gerçekleştirebilirsiniz.

Bu videoyu izledikten sonra, basit cihazdan proteinlerin ve nükleik asitlerin nasıl izole edileceği konusunda net bir anlayışa sahip olmalısınız. Videomuzu izlemeye vakit ayırdığınız için teşekkür ederiz.