Geleneksel ve Holografik Optik Yakalama Yetenekleri ile bir Yüksek Çözünürlüklü Mikroskop İnşaatı
22 Nisan 2013
Burada açıklanan sistemi birden fazla tuzakları oluşturma ve manipüle yeteneğine sahip geleneksel optik tuzak yanı sıra bağımsız bir holografik optik yakalama çizgi, istihdam. Ayrıca biyolojik enzimlerin aktivitesini aynı anda yüksek hızlı, yüksek çözünürlüklü ölçümler izin ise bu kırma parçacıkların karmaşık geometrik düzenlemelerin oluşturulmasını sağlar.
Bu prosedürde, geleneksel ve holografik bir optik yakalama hattı monte edilir ve hizalanır Bunu gerçekleştirmek için önce optik bileşenlerin konumlarını ölçün, ardından bileşenleri uygun konumlarına güvenli bir şekilde monte edin. Ardından, yakalamaya izin vermek için optikleri hizalayın. Son adım, holografik aynadan gelen TED ışınını engellemektir.
Nihayetinde, bitmiş sistem aynı anda holografik ve sıradan yakalamaya izin verir. Bu tekniğin tek başına sıradan yakalama gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, birden fazla kırılma nesnesinin üç boyutta aynı anda konumlandırılmasına ve hızlı nesne manipülasyon ölçümlerine izin vermesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü tasarım, düzen ve hizalama zor olabilir.
Bu videonun başlangıç noktası, 980 nanometrede bir optik tuzak oluşturmak için mikroskobun yerinde olduğu bir optik tezgahtır. Bu dalga boyunun kolayca bulunabilen lazer diyotlarından biriyle başlayın. Bilinen mod alan çapına sahip tek modlu fiberi koruyarak polarizasyonlu bir domuz eğim lazeri kullanın.
Fiber, bir mod filtresi görevi görecek kadar uzun olmalı ve bir FCPC veya bir FCAC konektörüne sahip bir fiber kanal konektörü ile sonlandırılmalıdır. Tek modlu fiber optik dikkatli kullanılmalı, bükülmelerden kaçınılmalıdır. Güç ve sıcaklık kontrolüne izin veren lazer diyotu ve montajı sabitleyin.
Pasif ısı emiciyi en üst düzeye çıkarmak için montaj doğrudan optik tezgaha takılmalıdır. Ardından, fiber konektörü ışın harmanlama optiğine monte edin. Seçilen fiber bağlantı noktasının diyotun mod alanı çapıyla eşleştiğinden emin olun.
Pigtail fiber, ışın yönlendirme, genişleme ve diğer bileşenlerin yerleştirilmesine izin vermek için harmanlama adaptörünü mikroskoptan yeterli bir mesafede optik masaya takın. Çubuk renkleri, sağlam, tekrarlanabilir konumlandırma için lens aralığını sabitlemek için kullanılabilir. Mikroskoba giden genel ışın yolu ile karşılaştırılabilir mesafelerde tutarlı ışın atığı sağlamak için fiber bağlantı noktasını ayarlayın.
DDE lazer ışınının yolunda beş ayna vardır. Lazer dde'den başlayarak, çıktısını mikroskop muhafazasına yönlendirmek için iki ayna vardır. Işın ayrıca, lazer diyot ışınının 45 derecelik bir açıyla olay açısına kadar azalmadan iletilmesine izin veren dikroik bir aynadan geçmelidir.
Son olarak, görünür ışığı ileten, ancak yakın kızılötesi ve üzerini yansıtan iki ek kısa geçişli diic ayna. Işını mikroskobun içine ve dışına yönlendirin. Sonsuzluk alanı, aynaları ayarlamak, mikroskop objektifini çıkarmak için mikroskop muhafazasının içindedir.
Objektif montaj aşamasında ışını açıklıktan geçirmek için aynaları ve kızılötesi görüntüleme kartını kullanın. Işın merkezden uzaksa, ışın merkezde olacak şekilde hizalamayı sabitlemek için aynaları ayarlayın. Lensleri monte ederken, bir kafes sistemi sağlam bir montaja neden olabilir.
Kaliperler, kurulumdan önce kafes çubukları boyunca lensler arasındaki mesafeleri önceden ölçmek için kullanılabilir. Işını mikroskobun optik ekseni boyunca olacak şekilde objektifin yerine özel bir adaptöre sahip kırmızı bir lazer işaretçiyi geçici olarak monte edin. 980 nanometre ışın genişleticiyi yerleştirmek ve kabaca hizalamak için görünür lazer işaretçi ışınını kullanın.
Bu kurulum, ışın belini yaklaşık iki katına çıkarmak için keary düzenlemesinde 60 milimetre ve 125 milimetre odak uzaklığına sahip lensler kullanır. Ardından, işaretçi ışınını burada kılavuz olarak kullanarak 980 nanometre direksiyon lenslerini takın. Her lensin 60 milimetre odak uzaklığı yuvası vardır, ışın yönlendirmesine izin vermek için en az yarım inç hareket aralığına sahip hassas bir X, Y, Z aşamasında ışın yolundaki ilk lens.
İkinci lens artık ilk lensle bire bir keary düzenlemesi oluşturacak şekilde konumlandırılabilir. Bu lens, objektifin arka odak düzlemine optik olarak konjuge olacak şekilde konumlandırılmalıdır. Holografik tuzağı hazırlamak için, 1064 nanometre lazeri kabaca 980 nanometre ışının yüksekliğinde yükseltilmiş bir platforma monte edin.
Lazer çıkışından hemen sonra bir yarım dalga plakası ve polarizör yerleştirin. Lazer gücünün manuel olarak ayarlanmasına izin vermek için. Bu lazer için ışın genişleticiyi takın, böylece ışın atığı holografik aynanın diyagonal boyutuna uyacak şekilde genişletilir.
Alanla kısıtlıysa, burada 16 milimetre ve 175 milimetre gibi küçük odak uzaklığına sahip lensler kullanın. Şimdi, kullanılan ticari holografik paketin bir parçası olan uzamsal ışık modülatörünü veya SLM'yi konumlandırmak için lazer işaretçi ışınını kullanın. Bu deneyde, uzamsal ışık modülatörü, objektifin arka odak düzlemine optik olarak konjuge edilecek şekilde konumlandırılmalıdır.
Lazer işaretçi ışını mümkün olan en az olay açısına sahip olacak, ancak yansıması optik tabla üzerindeki tüm donanımı güvenli bir şekilde temizleyecek şekilde yerleştirin. Işığını uzamsal ışık modülatörüne yönlendirmek için 1064 nanometre lazer ışını genişleticinin önüne başka bir ayna yerleştirin. Lazer işaretçi ışığının ışın genişletici açıklığının ortasına çarptığından emin olun.
Son olarak, uzamsal ışık modülatörü ile dikroik ayna arasına bir teleskop merceği yerleştirin. Bu lenslerin odak uzaklıkları 125 milimetre ve 200 milimetredir. Lazer işaretçiyi çıkarın, özel adaptör montajını rota hizalama açıklığı olarak hizmet etmesi için bırakın.
Yalnızca 980 nanometre ışını kullanarak hizalamayı kontrol etmeye başlayın. 980 nanometre ışını, özel adaptördeki diyafram açıklığının merkez ekseni boyunca ilerleyecek şekilde hizalamak için bir kızılötesi kart görüntüleyici kullanın. Ardından, 1064 nanometre ışının, paylaşılan ışın yolu boyunca 980 nanometre ışınıyla aynı noktalara çarptığından emin olmak için kızılötesi kartı kullanın.
Bu yapıldıktan sonra, özel lazer işaretçi montaj adaptörünü yüksek sayısal açıklıklı bir yağ veya su objektifi ile değiştirin. Ardından, holografik ayna kapalıyken kamerada radyal olarak simetrik bir girişim deseni görülene kadar lazer ışınını yürüterek 980 nanometre tuzağını hizalayın. Uzamsal ışık modülatörünü ve UN DEFRACTED 1064 nanometre ışınını yürüten ilk dikroik aynayı kullanarak 1064 nanometre tuzağını hizalayın.
Bu örnekte, her iki bindirme için hizalanmış görüntü, verimli bindirme için iyi bir hizalamayı gösterir, ancak daha da iyileştirilebilir. Ayrıca, yuvarlak 1064 ışınla ilişkili, kare bir SLM aynasına çarpan ve lens hizalamasının rafine edilmesiyle kolayca ortadan kaldırılamayan küçük sapmalar da vardır. Uzamsal ışık modülatöründen etkisiz hale getirilen ışın tarafından üretilen tuzağı engellemek için, bu sistem için örnek düzleme eşlenik bir konumda, etkisiz ışığın yoluna küçük bir opak nesne yerleştirin.
Metal olan 100 ila 300 mikron çapında opak bir mikro küre, kızılötesi şeffaf yuvarlak bir cam kapak kızağına veya pencereye yapıştırılır. Blok, numune düzlemine optik olarak konjuge edilen lenslerin ortak odak noktasına yerleştirilir. Optik yakalama ışınları mikroskobun sonsuz uzayına enjekte edilirse, ışın engelleyici yarışsız ışığı engelleyecek şekilde konumlandırılabilir veya tüm ışığın geçmesine izin verecek şekilde hareket ettirilebilir.
Birleştirilmiş kurulum, operatörün birden fazla kırılma nesnesini gerçek zamanlı olarak yakalamasına ve bunları görüş alanındaki üç boyutta da konumlandırmasına olanak tanır. Burada, enstrümanın holografik yetenekleri, deiyonize suda asılı duran mikro kürelerin yakalanmasıyla gösterilir, kırmızı ve yeşil daireler tuzak konumlarını gösterir ve yeşil, bu klipte yeniden konumlandırma için seçilen bir tuzağı gösterir, bir nesne yakalandıktan sonra oynatma hızlandırılır. Tuzağı manuel olarak yeniden konumlandırılır.
Son düzenlemede, bu deneyin yapıldığı Utah Üniversitesi'nin logosunu gösteren 11 boncuk var. Sistem aynı zamanda hem holografik hem de konvansiyonel tuzakların bir arada kullanılmasına olanak sağlar. Burada iki sıra holografik tuzak tanımlanır ve operatör tarafından kontrol edilir.
İki sıra arasında ek bir geleneksel tuzak tanımlanır. Deiyonize suda asılı kalan mikroküre tuzaklar tarafından bağlanır. Merkez boncuk, maksimum 4.1 mikrometrelik bir uzamsal yer değiştirmeye hareket ettirilir ve daha sonra aynı koşullar altında orijinal konumuna geri çekilir.
Ancak merkez boncuk saniyede 82 mikrometre hızla hareket ederken, bu çerçeve dizisi üretilir. İkinci ve üçüncü görüntülerdeki hareket bulanıklığına dikkat edin. Bu videoyu izledikten sonra, aynı kurulumda bağımsız holografik ve normal tuzak ile çift optik tuzak sistemini nasıl düzenleyeceğinizi ve hizalayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.
Yüksek güçlü lazerlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve uygun koruyucu gözlük takmak gibi önlemler alın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, geleneksel ve holografik optik hapsetme tekniklerini entegre ederek çoklu tuzakların manipülasyonuna olanak tanıyan bir sistemi tanımlamaktadır. Bu yenilikçi yaklaşım, kırıcı parçacıkların karmaşık geometrik düzenlemelerinin oluşturulmasını kolaylaştırırken, biyolojik enzim aktivitesinin yüksek hızlı ve yüksek çözünürlüklü ölçümlerine imkan tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Optik tuzaklama
- Biyofizik
- Enzim aktivitesi ölçümü
Arka Plan
- Geleneksel optik tuzaklama yöntemleri, birden fazla nesneyi eş zamanlı olarak manipüle etme yetenekleri bakımından sınırlıdır.
- Holografik optik tuzaklama, partiküllerin konumlandırılması ve manipülasyonunda gelişmiş bir esneklik sunar.
- Bu tekniklerin birleştirilmesi, ölçüm doğruluğunu ve hızını artırabilir.
- Yeni kullanıcılar, optik bileşenlerin tasarımı ve hizalanmasında zorluklarla karşılaşabilir.
Çalışmanın Amacı
- Aynı anda hem konvansiyonel hem de holografik optik tutma işlemine izin veren bir sistem geliştirmek.
- Kırıcı indeksli birden fazla nesnenin üç boyutta manipülasyonunu sağlamak.
- Biyolojik enzim aktivitesinin hızlı ölçümlerini kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Optik tuzaklama bileşenlerinin montajı ve hizalanması.
- Optik bileşenlerin konumlarının ölçümü.
- Bileşenlerin belirlenen pozisyonlara güvenli şekilde sabitlenmesi.
- Etkili tuzaklamayı sağlamak için optiklerin hizalanması.
Ana Sonuçlar
- Sistem, konvansiyonel ve holografik hapsetme tekniklerini başarıyla entegre etmektedir.
- Birden fazla kırıcı nesnenin aynı anda konumlandırılmasına olanak tanır.
- Enzim aktivitesinin yüksek hızlı ölçümleri gerçekleştirilmiştir.
- Kullanıcılar başlangıç kurulumunda zorluklar yaşadıklarını bildirmiş ancak sistemin avantajlarını kabul etmişlerdir.
Sonuçlar
- Geliştirilen sistem, optik tuzaklama tekniklerinin kabiliyetlerini artırmaktadır.
- Biyolojik süreçleri inceleyen araştırmacılar için önemli avantajlar sağlamaktadır.
- Yeni kullanıcıların düzeneğe tam olarak hakim olabilmesi için ek eğitim gerekebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Optik tuzaklama sistemleri, nanometre ve pikonewton ölçeklerinde yüksek çözünürlüklü kuvvet ve hareket ölçümleri için kırıcılık indeksine sahip nesnelerin hassas manipülasyonuna olanak tanır. Geleneksel ve holografik tuzaklamanın entegrasyonu, eş zamanlı çoklu nesne konumlandırmasına ve gerçek zamanlı 3D kontrole imkan tanıyarak, moleküler etkileşimlerin ve hücresel mekaniğin mekanistik çalışmalarını destekler. Bu yetenek, bağlanma kuvvetlerinin ve fizyolojik koşullar altındaki konformasyonel değişikliklerin kantitatif değerlendirmesini sağlayarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Moleküler bağlanma kuvvetlerinin ve kompleks oluşum dinamiklerinin doğrudan ölçümü yoluyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Moleküler motorlar veya enzim aktivitesi tarafından gerçek zamanlı olarak üretilen pikonewton ölçeğindeki kuvvetleri ölçerek fonksiyonel hedef doğrulaması sağlar.
- Öngörücü Değer: Hedef etkileşimi ve etki mekanizması ile ilişkili nicel kuvvet-yer değiştirme verileri üreterek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Dielektrik boncukların veya hücresel organellerin kuvvet sensörleri olarak kontrollü manipülasyonuna olanak tanıyarak, alt akış iş akışları için valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Tuzak konumunun nesne hareketine göre hassas konumlandırması ve eş zamanlı okuması aracılığıyla analiz standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Görüş alanındaki birden fazla nesnenin paralel olarak tutulması için holografik desen oluşturma yoluyla tarama hazırlığını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Primer hücrelerde veya doku türevli modellerde, fizyolojik koşullara yakın şartlar altında nanoölçekli mekanik özelliklerin ölçülmesine olanak tanıyarak hastalıkla olan ilgiyi korur.
- Mekanistik Risk Azaltma: Keşif aşamasındaki gözlemleri, hedef modülasyon stratejilerini bilgilendiren kuvvet üretim çıktıları aracılığıyla preklinik doğrulamaya bağlar.
- Risk Ayarlı İlerleme: Pertürbasyonların hastalıkla ilgili sistemlerdeki mekanik çıktıyı nasıl etkilediğini nicelendirerek devam/dur kararlarını destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Sistem, hedef önceliklendirme ve mekanizma aydınlatılmasına temel teşkil eden kantitatif biyofiziksel okumalar sağlayarak, hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Protein komplekslerindeki moleküller arası kuvvetlerin ve konformasyonel değişimlerin doğrudan ölçümüne olanak tanıyarak hipotez testlerini ve yolak netleştirmelerini destekler.
- Tarama: Yakalanan nesnelerin yüksek hızlı ve yüksek çözünürlüklü konum takibi aracılığıyla assay hazırlığı sağlayarak, kuvvet tabanlı okumalar üzerinden güvenilir bileşik değerlendirmesini kolaylaştırır.
- Analizler: Ekiplerin koşulları karşılaştırmasına ve hedef modülasyon etkinliğini değerlendirmesine olanak tanıyan nanometre ölçekli yer değiştirme ve pikonewton kuvvet ölçümleri üretir.
- Translasyonel Araştırma: Hastalıkla ilişkili hücresel sistemlerde mekanik fenotiplemeye imkan tanıyarak preklinik süreklilikle bağlantı kurar ve mekanotransdüksiyon yolakları için biyobelirteç uyumunu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Projeler genelinde çok parametreli analizler için yeniden kullanılabilir bir platform görevi görerek tekrarlayan kurulumları azaltır ve kuvvet ölçüm protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu sağlar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef mekanizma yorumlamasındaki belirsizliği azaltan mekanik çıktıların doğrudan, etiketsiz ölçümü aracılığıyla öngörü güvenilirliği sağlar.
- Operasyonel Değer: Holografik tuzaklama paternleri ve eş zamanlı çoklu nesne kontrolü ile standartlaştırma ve ölçeklenebilirlik sağlayarak kuvvet ölçüm kampanyalarındaki verimliliği artırır.
- Stratejik Değer: Nicel kuvvet verileri aracılığıyla hedeflerin erken aşamada riskten arındırılmasını sağlayarak sermaye verimliliğini artırır ve öngörülemeyen mekanik yükümlülüklerden kaynaklanan geç aşama başarısızlıklarını azaltır.
- Portföy Etkisi: Aday moleküller genelinde hedef etkileşim gücü ve konformasyonel dinamikler hakkında objektif, nicel veriler sunarak riskle ayarlanmış önceliklendirmeye temel oluşturur.
Uygulama Hususları
- Çift dalga boylu tuzaklama sistemleri için optik hizalama, lazer güvenliği ve ışın yolu optimizasyonu konularında uzmanlık gerektirir.
- 980 nm ve 1064 nm lazer entegrasyonu için stabil optik masa altyapısına, hassas translasyon kademelerine ve kızılötesi uyumlu bileşenlere bağımlıdır.
- Kuvvet ve yer değiştirme okumaları için tuzaklama protokollerinin, kalibrasyon prosedürlerinin ve veri analiz hatlarının ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Değişen kırılma indisleri ve örnek canlılık kısıtlamaları nedeniyle, boncuk tabanlı analizlerden primer hücrelere veya doku eksplantlarına geçişte adaptasyon değerlendirmeleri içerir.
- Hizalama karmaşıklığı ve özellikle holografik desenlerin uzaysal ışık modülatörü geometrisiyle etkileşime girdiği durumlarda, uyumsuz ışın profillerinden kaynaklanan potansiyel aberasyonlarla sınırlıdır.
