تحليل وظيفة GTPases الصغيرة التي Microinjection من البلازميدات إلى الخلايا الظهارية المستقطب

يختبر هذا الإجراء تأثيرات الـ GTP ACEs الصغيرة على نقل الغشاء المستقطب. أولاً، يتم حقن البلازميدات الحمضية النووية DNA التي تشفر الـ GTP ACE الصغيرة والبروتينات الكاشفة معاً في نوى الخلايا المستقطبة. بعد ذلك، يتم التعبير عن الـ DNA في درجات حرارة تؤدي إلى إيقاف البروتينات الكاشفة في الشبكة الإندوبلازمية أو في شبكة ترانس جولجي TGN بينما يتراكم الـ GTPA الصغير في العصارة الخلوية، ثم يتم تتبع البروتين الكاشف وصولاً إلى سطح الخلية في وجود cyclo heide لمنع المزيد من تخليق البروتين.

وأخيراً، قم بوسم البروتين المراسل على سطح الخلية لتحليله عن طريق التألق المناعي. تسمح النتائج التي يتم الحصول عليها من هذا المقايسة بتصور التغير في التموضع السطحي عبر المجهر البؤري. والميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل transfection هي أنه خلال الفترات القصيرة من فرط التعبير التي يتم تحقيقها عن طريق الحقن المجهري، تكون التأثيرات الثانوية في حدها الأدنى، مما يسمح لنا بدراسة التأثيرات الأولية للبروتينات المستهدفة.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال قطبية الخلية، مثل كيفية تنظيم بروتينات gtpa الصغيرة لنقل الغشاء المستقطب. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن الخطوات الفردية اللازمة لعملية حقن مجهري ناجحة يصعب شرحها دون مساعدة بصرية. قم بعزل الحمض النووي البلازميدي (plasma DNA) الخالي من السموم الداخلية باستخدام مجموعة Sigma Aldrich endotoxin free maxi prep وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. وبالنسبة لهذه التجربة، استخدم ثلاثة مرشحات transwell شفافة بقطر 12 مليمتر وحجم مسام 0.4 ميكرومتر للاستزراع.

توضع الخلايا بواقع 4 × 10 من خلايا MDCK الخامسة على كل مرشح. بعد مرور يومين، يتم فحص المزرعة تحت المجهر للتحقق من نمو الخلايا في طبقة أحادية مغلقة. وذلك من أجل الحقن المجهري.

في يوم الحقن المجهري، قم بتحضير أطباق بمقاس 360 في 15 مليمتر تحتوي على خمس لترات من وسط نمو MM مضافاً إليها 15 مليمتر heis، ثم ضعها في حاضنة عند درجة حرارة 39 °C. بالإضافة إلى ذلك، قم بتحضير ثلاثة أطباق ذات 12 بئراً تحتوي على ملليمتر واحد من وسط نمو MEM مضافاً إليه 50 millimolar heis و 0.1 mg/mL من السيكلوهيكسيميد (cycloheximide)، وضعها في حاضنة عند درجة حرارة 31 °C. قم بتشغيل مجهر الحقن المجهري، وهو مجهر مقلوب مجهز بمنصة مسخنة وعدسات شيئية بقوة تكبير 10x و 32x، وجهاز einor femto jet.

اضبط المنصة المسخنة على 39 °C. كما يجب فتح إمدادات خزان غاز النيتروجين إلى طاولة الهواء. الآن، قم بتخفيف الـ DNA باستخدام الماء المفلتر للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.2 mg/mL.

بعد ذلك، قم بطرد الحمض النووي DNA في جهاز طرد مركزي دقيق بسرعة 13,000 RPM لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة الجزء العلوي ووضعه في أنبوب جديد. بعد ذلك، قم بتحضير خلايا MDCK عن طريق إخراج المرشح الأول من طبق المزرعة باستخدام شفرة جراحية، وقص المرشح من حامل المرشح ووضعه في طبق مُعد بمقاس 60 × 15 مليمتر يحتوي على خمسة مليلتر من وسط نمو MEM المُدفأ عند 39 درجة Celsius مضافاً إليه 50 مليمولار من heis.

لتثبيت المرشح في طبق المزرعة، ضع الشفرة الجراحية في مركز المرشح ثم انقل طبق المزرعة إلى المنصة المسخنة للمجهر. قم بتحميل 2 إلى 3 µL من الـ DNA المخفف في إبرة الحقن المجهري. قم بتدوير الغطاء الواقي للإبرة واتركه ليسقط على الأرض.

لتثبيت الإبرة في الحامل، اضغط على مفتاح القائمة في جهاز الحقن وتأكد من إغلاق الصمام. قم بربط الإبرة في حاملها. احذر من ربط الإبرة بإحكام زائد.

بما أن ذلك قد يؤدي إلى الكسر، اضغط على مفتاح القائمة مرة أخرى. وبذلك سيمنع ضغط التعويض المطبق سحب الوسط إلى داخل الإبرة أثناء إجراء الحقن المجهري. وأخيراً، انقر على عصا التحكم لمسح وضع العودة للمنزل (homing) المخزن لخفض الإبرة فوق الخلايا.

استخدم العدسة الشيئية 10x وحرّك الإبرة لتصبح ضمن حزمة الضوء فوق السائل. الآن، قم بضبط التركيز على الخلايا. أعد ضبط التركيز للأعلى عن طريق تدوير عجلة التركيز بمقدار 180 درجة للأعلى وحدد موقع الإبرة.

حرك الإبرة ببطء حتى تصبح في بؤرة التركيز. ثم أخرجها من بؤرة التركيز مرة أخرى. واعمل على إعادة الخلايا إلى بؤرة التركيز مجدداً.

أعد ضبط بؤرة الإبرة للأسفل مرة أخرى. كرر هذه العملية حتى تلامس الإبرة سطح الوسط، وعند هذه النقطة ستلاحظ ظهور هالة. استمر في الضبط حتى تصبح الخلايا في بؤرة التركيز، بينما تظل الإبرة غير واضحة لكونها خارج المستوى البؤري.

انتقل الآن إلى العدسة الشيئية 32x واضبط إعدادات التركيز التقريبي. حدد حد المحور Z من خلال ملامسة الغشاء القمي بطرف الإبرة ثم طرح حوالي 10 micrometers، وذلك لأن النوى تقع على عمق 10 micrometers تقريباً تحت الغشاء القمي.

الآن، قم بإخراج الإبرة بضع ميكرونات خارج المستوى البؤري بأسرع ما يمكن. وجّه الإبرة لتكون فوق النواة، ثم اضغط على زر الحقن في عصا التحكم وأفلته. ابدأ بضغط 95 PSI للعثور على ضغط الحقن المناسب.

إذا كان الضغط مرتفعاً جداً، فإن الخلايا تنفجر. أما إذا كان الضغط منخفضاً جداً، فتظل هناك نقطة بيضاء، ولكن لا يحدث شيء آخر. قم بإجراء عملية حقن ناجحة تتضمن تغيراً في الطور دون حدوث تغير في حجم الخلية.

احقن من 100 إلى 500 خلية داخل ثقب الشفرة الجراحية الموجودة فوق الخلايا. ثم ضع الخلايا مع طبق الزرع والشفرة الجراحية في حاضنة عند درجة حرارة 39 °C واحضنها لمدة ساعتين. وأخيراً، انقل الخلايا إلى طبق 12 well plate المجهز والذي يحتوي على 1 mL من MEM بالإضافة إلى 50 mM و 0.1 mg/mL من cyclo heide، واحضنها لمدة ساعتين عند درجة حرارة 31 °C.

لتجنب تلاشي إشارة GFP المُعبر عنها، احمِ العينات من الضوء بتغطيتها بورق ألومنيوم خلال جميع إجراءات صبغ السطح اللاحقة. ضع طبق المزارع الخلوية على صفيحة معدنية فوق الثلج وقم بالغسل مرة واحدة باستخدام PBS plus plus مبرد بالثلج، ثم ضع قطعة نظيفة من البارافورم على الصفيحة المعدنية فوق الثلج، واستخدم الماصة لوضع قطرات بحجم 30 microliter من جسم مضاد يتعرف على النطاق الخارجي (ecto domain) للبروتين المستهدف.

ضع الآن المرشح الذي يحتوي على الخلايا مقلوباً فوق القطرة، وأضف بضع قطرات من الجسم المضاد على الجانب الخلفي للمرشح. يتم التحضين لمدة ساعة واحدة على الثلج. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS++ بارد جداً، ثم قم بتثبيتها باستخدام paraform aldehyde بتركيز 3% لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

باشر بغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS++ واتركها لتتوازن في PBS++ لمدة خمس دقائق. الآن قم بتحضين الخلايا في محلول حجز نفاذ (blocking permeable buffer). يتم التحضين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، مع تخفيف الأجسام المضادة الأولية بنسبة 1 إلى 200 في محلول BPB للكشف عن RAB GTP ACE المُعبر عنه؛ ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق بسرعة 13,000 RPM، وانقل بواسطة الماصة 30 µL من محلول الأجسام المضادة على شريحة نظيفة موضوعة في غرفة رطبة.

ضع الخلايا على المرشح مقلوبة فوق قطرات الأجسام المضادة واتركها للحضن لمدة ساعة واحدة. في درجة حرارة الغرفة، أعد الخلايا إلى وضعها الصحيح داخل طبق يحتوي على 12 بئراً، واغسلها خمس مرات على مدار 30 دقيقة باستخدام BPB في درجة حرارة الغرفة بعد الحضن مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة، بما في ذلك خطوة الغسيل.

اغمس الخلايا الموجودة على المرشح ثلاث مرات في الماء منزوع الأيونات وضعها بحيث يكون الجانب الأيمن للأعلى على شرائح مجهرية مع إضافة 10 microliters من مادة التثبيت. ضع غطاء شريحة مجهرية مقاس 18 by 18 millimeter في الأعلى، وباستخدام مناديل ورقية، اضغط بلطف على غطاء الشريحة فوق الخلايا. أخيراً، قم بالختم باستخدام طلاء الأظافر في حالة الحقن الصوري للبلازميد الذي يشفر V-S-V-G-T-S-O 45 GFP فقط. يتم توصيل البروتين إلى السطح القاعدي الجانبي لخلايا MDCK ذات الاستقطاب الجيد، كما يتضح من الصبغ السطحي الأحمر في الخلايا التي لا تتمتع باستقطاب جيد.

سيتم نقل جزء من بروتين GFP المدمج إلى الغشاء القمي. وإذا ظهرت العينات الضابطة بهذا الشكل، فلا يمكن الوثوق بالبيانات ويجب تكرار التجربة باستخدام خلايا ذات استقطاب أفضل. لاحظ أن ليس كل بروتين GFP المدمج الذي تم التعبير عنه يتم نقله إلى الغشاء القاعدي الجانبي أثناء فترة المطاردة عند 31 °C، كما يتضح من الإشارة الخضراء الواسعة داخل الخلايا للبروتين الكلي. بمجرد إتقان هذه التقنية، ينبغي أن تستغرق حوالي 10 إلى 12 ساعة بعد تطويرها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال نقل الغشاء لاستكشاف البروتينات التنظيمية في الخلايا الظهارية المستقطبة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعبير عن البروتينات في الخلايا الظهارية المستقطبة باستخدام تقنية الحقن المجهري.