جيل وتنقية، وتوصيف الأنواع الغازية خلية البروتين DISC1

الهدف العام من الإجراءات التالية هو إنتاج أقراص منقاة. أولاً، تجمعات قادرة على غزو الخلايا المستقبلة. سيتم استعراض طريقتين مختلفتين لتحقيق هذا الهدف مع البدء بالطريقة الأولى.

يتم التعبير المفرط عن البروتين المندمج disc one، وهو بروتين فلوري يشكل الأجسوم، في خلايا مانحة من الورم الأرومي العصبي البشري NLF. ثم تُغسل الخلايا باستخدام PBS وتُجمع وتُحلل دون استخدام المنظفات. بعد ذلك، يتم هضم DNA وتنقيتها المناطق الأغروزية باستخدام نظام تدرج السكروز.

تتميز جزيئات Agrios المنقاة بهذه الطريقة بكفاءة منخفضة في غزو الخلايا. ويتمثل النهج البديل في الإفراط في التعبير عن الأحماض الأمينية 5 98 إلى 7 85 من بروتين disc one المؤتلف في بكتيريا e coli. بعد ذلك، يتم وسم قطعة البروتين باستخدام DITE 5 94، ثم تُجرى لها عملية ديالة وتنقية باستخدام مصفوفة NI NTA التي تعمل على إزالة أي صبغة غير مرتبطة متبقية أو مجمعات disc المتعددة القسيمات.

تمتلك الشظايا الناتجة عن هذه الطريقة كفاءة عالية في غزو الخلايا لتقييم غزو الخلايا المضيفة. سواء كان ذلك باستخدام قرص البروتين الفلوري المنقى، أو الريبوسومات، أو القرص المؤتلف المسمى. يتم تحضين شظية واحدة مع الخلايا المستلمة المستهدفة.

يتم بعد ذلك إضافة صبغة Trian blue لإخماد الفلورة خارج الخلوية، ويتم تصوير الغزو بواسطة المجهر البؤري. وحتى الآن، لم يتم اعتبار تجمع البروتينات سمة مميزة للأمراض العقلية المزمنة مثل الفصام. وفي الحالات التي يكون فيها بروتين واحد مرشحاً للاختلال في مرض الفصام، فإن القدرة الغزوية للخلايا الناتجة عن تجمعات البروتين تعد سمة مميزة لأمراض طي البروتين.

نوضح هنا من خلال طريقتين أن تجمعات بروتين disc one الغزوية للخلايا، ومن ثم فإن الاضطرابات المرتبطة بـ disc one أو اعتلالات disc one العصبية هي اضطرابات في التكوين البروتيني. تتمثل الطريقتان في: أولاً، تنقية بروتينات disc one ASOS كاملة الطول من خطوط خلايا الورم الأرومي العصبي (neuroblastoma)، وثانياً، التعبير عن قطعة multimeric من الطرف الكربوكسيلي (C terminal) لبروتين disc one في بكتيريا e coli، بالإضافة إلى التنقية والوسم باستخدام صبغة فلورية.

بينما تؤدي الطريقة الأولى فقط إلى غزو خلوي منخفض الكفاءة بنسبة 0.3% تقريبًا من الخلايا التي امتصت الميكروسومات المنقاة، فإن قطعة البروتين المؤتلف المنقاة تصيب ما يصل إلى 20% من الخلايا المعرضة. يجب أن تكون الطرق الموضحة هنا قابلة للنقل إلى بروتينات أخرى تم فيها إثبات تكوين الأكروسوم أو التجميع المتعدد الوحدات بشكل مقنع. في كل طبق من أطباق الـ 10 10 سنتيمتر.

قم بستزراع 1.5 × 10⁶ من خلايا الورم الأرومي العصبي البشري وخلايا LF في وسط RPMI 1640 المدعم واتركها لتنمو طوال الليل. في اليوم التالي، يجب أن تصل نسبة تلاقي الخلايا إلى 70% إلى 80%؛ قم بتمييز خمسة أطباق لعملية التعدي (transfection) باستخدام PC DNA 3.1 MRFP وhuman full-length disc 1 الموسوم بـ EGFP، وخمسة أطباق أخرى لعملية التعدي باستخدام بلازميد EGFP وحده. لكل طبق قطر 10 سنتيمتر، اخلط 15 µg من DNA البلازميد و30 µL من met affecting و750 µL.

وضع Opti MEM في أنبوب طرد مركزي دقيق والمزج عن طريق السحب والدفع بالمصّة، ثم التحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، ولإجراء عملية عفن الخلايا، يضاف محلول كاشف عفن الـ DNA قطرة تلو الأخرى إلى الخلايا، ثم تُحضن الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5%CO 2. وبعد 48 ساعة من عملية العفن، يتم رصد تعبير MRFP full length disc one والتأكد من تكوّن agro zones باستخدام المجهر الفلوري. تحتوي بعض الخلايا على اشتمالات بروتينية فلورية ضخمة كما هو موضح هنا.

يجمع هذا البروتوكول بين طريقة لتنقية أجسام ليوي (Lewy bodies) من أنسجة الدماغ وبروتوكول لعزل التجمعات الأكبر أو مناطق الأجرو (agro zones)؛ ونظراً لأن الطرق الحالية تعتمد على استخدام المنظفات، فإن عزل البروتين الخالي من المنظفات أمر بالغ الأهمية للتطبيق في مقايسات الغزو الخلوي. بعد ذلك، اشفط الوسط واغسل بـ PBS وأضف 400 µL من PBS الذي يحتوي على كوكتيل مثبط البروتياز. ثم اكشط الخلايا وأضف 1 mL من معلق الخلايا و10 خرزات سيراميكية إلى أنبوب تحلل سعة 2 mL.

قم بتحليل الخلايا باستخدام ثلاث نبضات مدتها 62 مللي ثانية في جهاز التجانس pre-cell lyse 24. قد تؤدي القوة الميكانيكية لهذه العملية إلى رفع درجة الحرارة داخل العينة إلى ما فوق 37 °C؛ لذا يجب الحرص على تبريد العينة على الثلج. بعد عملية التحليل، وبعد تبريد الخلايا على الثلج، أضف 10 mM من كلوريد المغنيسيوم و40 units/mL من DNAA، ثم قم بالتحضين لمدة 60 دقيقة عند 37 °C مع الرج.

قم بتحضير 10 milliliters لكل من محلول السكروز بتركيز 80% و50% و20% وزن/حجم في PBS. ثم في أنبوبة مخروطية سعة 15 milliliter، قم بتحضير تدرج السكروز بالبدء بإضافة two milliliters من السكروز بتركيز 80%، تليها two milliliters من تركيز 50%، ثم two milliliters من تركيز 20% من السكروز. صب التدرج ببطء مع الحرص على عدم تعكير الطبقات التي تم صبها بالفعل.

بعد ذلك، ضع الطبقة العلوية من المستخلص المهضوم فوق التدرج، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 1000 ×g ودرجة حرارة 4 °C. بعد توقف الجهاز، اجمع بعناية المنطقة البينية بين طبقتي السكروز 50% إلى 80% باستخدام ماصة، ثم اخلطها مع خمسة أضعاف حجمها في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل، واطرد مركزيًا لمدة 15 دقيقة عند 1000 ×g ودرجة حرارة 4 °C. أزل السائل الطافي بعناية واحتفظ بالراسب الموجود في المنطقة الغنية.

كرر عملية الغسل مرتين إضافيتين في هذه الواجهة. تكون مناطق Agri فلورية ويمكن رؤيتها بالمجهر تحت الأشعة فوق البنفسجية UV بعد الغسلة الأخيرة، تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 250 إلى 500 µL من PBS. يحتوي هذا الراسب على مناطق agro المنقاة.

أضف 10 µL من معلق MRFP disc, one asome إلى كل بئر من أطباق ذات 24 بئرًا تحتوي على خلايا SHSY five Y (خلايا ورم أرومي عصبي بشري) التي تعبر بشكل مستمر عن soluble GFP disc one C terminus على شرائح زجاجية معقمة، ثم حضنها لمدة تتراوح من 48 إلى 72 ساعة. بعد انتهاء فترة التحضين، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS وقم بإخماد الفلورة خارج الخلوية باستخدام 0.04% trian blue لمدة خمس دقائق.

ثم اغسل باستخدام PBS لإزالة صبغة trian blue. بعد ذلك، ضع الطبق على الثلج وأضف 4%PFA وPBS لمدة 10 دقائق لتثبيت الخلايا. ثم اغسل مرة واحدة بالماء المعقم وثبّت شرائح التغطية على شرائح زجاجية باستخدام وسيط التثبيت prolonged gold مع DPI.

تحقق من الامتصاص أثناء الغزو للمناطق المضافة خارجيًا عن طريق التموضع المشترك مع البروتينات المستقطبة التي تعبر عنها الخلايا المستقبلة في صور Zack. تشمل صور Zack هذه عمقًا يبلغ ستة ميكرومترات تقريبًا.

تم التقاط 24 صورة بخطوات قدرها 200 nanometers. ويظهر تألق منطقة agri في قرص MRFP one باللون الأحمر وهي تستقطب قرص GFPC الطرفي السيتوبلازمي. ويظهر التوضع المشترك لقطعة واحدة باللون الأخضر كـلون أصفر، مما يشير إلى أن مناطق agri قد دخلت إلى سيتوبلازم المستقبل واستقطبت بروتين قرص one الذي كان ذائباً سابقاً.

في هذا الجزء من البروتوكول، سيتم وسم human disc one باستخدام DITE 5 94. يتيح هذا الـ D المراقبة المباشرة للبروتين المؤتلف دون الحاجة إلى صبغ مناعي إضافي. ابدأ بتحرير البروتين المُحضَر كما هو موضح في المستند المرفق من beam mercaptoethanol عن طريق دياليزته ثلاث مرات في لترين من PBS بتخفيف قدره 1 إلى 2000.

بجانب وضع علامة على قرص واحد بوزن 1 mg، قم بإذابة البروتين بتركيز 1 mg/mL في PBS وأضف 5 mM من TCEP لاستعادة مجموعات TH الحرة. أضف 20 µL من الصبغة المذابة في DMF إلى التفاعل واحضن المزيج لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. باستخدام كاسيت دياليز SLI بحد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 10,000 Daltons، قم بإجراء دياليز للبروتين ثلاث مرات في PBS بنسبة 1:2000 لمدة ساعتين في كل مرة، وذلك لزيادة نقاء البروتين المسمى بشكل أكبر.

يتم إجراء تنقية بالألفة تعتمد على وسم الهستيدين (hiss tag) باستخدام عمود NI NTA. اغسل ملليلتر واحد من مصفوفة NI NTA بـ 10 ملليلتر من PBS، ثم ضع البروتين الموّسم والمُديلز على العمود واتركه يتدفق عبره.

سيفقد المحلول لونة الأزرق تدريجياً نتيجة ارتباط البروتين بمصفوفة NTA، بينما سيبقى الصبغ الحر غير المرتبط في السائل المار. بمجرد إدخال محلول البروتين في العمود، اغسل العمود ثلاث مرات باستخدام 20 milliliters من PBS، ولشطف البروتين، أضف 2 milliliters من PBS الذي يحتوي على 500 millimolar ole إلى العمود.

اضبط الصمام على السرعة البطيئة وقم بعملية الشطف قطرة بقطرة مع مراقبة الحزمة الملونة في عمود Ni-NTA. ومن الجدير بالذكر أن هذا الجزء الملون من السائل الشطفي يحتوي على بروتين مأشوب مُعلم؛ انقل السائل الشطفي إلى كاسيت دياليز SLI وأجرِ الديلزة للسائل الشطفي ثلاث مرات مقابل 10 millimolar NAPI بتخفيف قدره 1 إلى 2000 لمدة ساعتين في كل مرة باستخدام لترين بعد عملية الديلزة. مرر السائل الشطفي عبر مرشح حقنة معقم بمسامية 0.45 micrometer، ثم قسمه إلى خمس عينات بحجم 100 microliter لكل منها وقم بتجميدها سريعاً في النيتروجين السائل.

يجب أن تتراوح الكمية الإجمالية للبروتين من 0.5 إلى 1 µg/mL في كل حصة حجمها 100 µL. ولتقييم القدرة الغزوية للبروتين، أضف وسطاً يحتوي على 5 إلى 10 µg/mL من بروتين disc one المؤتلف والموسوم إلى كل بئر من أطباق ذات 24 بئراً تحتوي على خلايا SH SY five Y البشرية للورم الأرومي العصبي المستقبِلة. التي تعبر بشكل مستمر عن علامة GFP الذائبة عند الطرف الكربوكسيلي disc one C terminus على شرائح غطاء زجاجية معقمة، ثم تُحضن لمدة تتراوح من 48 إلى 72 ساعة.

قم بإخماد الفلورة خارج الخلوية ثم ثبت الخلايا وقم بتركيبها كما تم فعل ذلك مع الخلايا المعالجة في المنطقة الزراعية، وأكد غزو البروتين المؤتلف المضاف خارجيًا عن طريق تصوير Z-stack. عندما يتم امتصاص البروتين المسمى، يتم اكتشافه ضمن محيط الخلايا المستقبلة في الصور الناتجة عن المجهر البؤري (confocal microscopy). يشمل تصوير Z-stack هذا عمقًا يبلغ 5 micrometers تقريبًا موزعة على 24 خطوة بمقدار 220 nanometers لكل خطوة.

هنا يتم امتصاص قطعة disc one المعاد تركيبها 5 98 إلى 7 85 الموضحة باللون الأحمر بواسطة خلايا مستقبلة تعبر عن disc one القابل للذوبان والموسوم بـ GFP في الطرف C الموضح باللون الأخضر لتحديد مدى غزو تجمعات بروتين disc. One. تم تنقية أغروزونات (agro zones) مكونة من disc one كامل الطول وموسوم بـ MRFP من خلايا NLF وتطبيقها على خلايا SH SY five Y المستقبلة كما هو موضح في هذه الصورة. غزا أغروزوم disc one الموسوم بـ A-M-R-F-P خلية ورم أرومي عصبي بشري SH SY five Y تعبر عن disc one الطرف C القابل للذوبان والموسوم بـ GFP.

علاوة على ذلك، كان بروتين disc one المسمى بـ MRFP والموجود في الأجسام (asome) قادرًا على جذب بروتين disc one الذائب المسمى بـ GFP إلى تجمعات غير ذائبة؛ ولتحديد مدى القدرة على الغزو، تم تطبيق بروتين disc one المؤتلف والمسمى بـ DIA light على خلايا SH SY five Y لسرطان الخلايا العصبية (neuroblastoma) التي تعبر عن بروتين GFP disc one الذائب كما هو موضح هنا. لقد غزا بروتين disc one المؤتلف والمظهر باللون الأحمر الخلية المستقبلة، وتشير النقاط الصفراء إلى جذب الطرف الكربوكسيلي (C terminal) من بروتين disc one الذائب المسمى بـ GFP إلى التجمعات. كما كان بروتين disc one المؤتلف، الذي تم التعبير عنه وتنقيته من e coli، قادرًا على غزو الخلايا العصبية في الجسم الحي (in vivo) عند حقن البروتين متعدد القسيمات (multimeric protein) بالتوجيه المجسم (stereotactically) في القشرة أمام الجبهية الإنسية (medial prefrontal cortex) لجرذ. ويؤكد التصوير بـ Zack وجود بروتين disc one المؤتلف في العصبونات القشرية للجرذ المصبوغة بجسم مضاد ضد النوى العصبية.

لقد عرضنا لكم للتو طريقتين لتوليد تجمعات البروتين disc one لدراسة غزو الخلايا. وباستخدام أي من هاتين الطريقتين، يمكننا استقصاء التأثيرات الخلوية لامتصاص تجمعات disc one دون المتغيرات المربكة المحتملة للتعبير الجيني المؤتلف عن طريق ترنسفكشن DNA غريب. ويمكن تطبيق هذه التقنيات لدراسة التأثيرات البيولوجية لاعتلال بروتين disc one في المختبر (in vitro) في الخلايا، وفي الجسم الحي (in vivo) عن طريق التلقيح داخل الدماغ أو طرق الإعطاء الأخرى في النماذج الحيوانية.

نحن واثقون من إمكانية نقل هذه التقنيات في النهاية إلى تجمعات بروتينية أخرى مع إجراء تعديلات طفيفة على البروتوكول المعتمد لكل بروتين على حدة. وعند تنفيذ هذا الإجراء، تأكد من تخصيص وقت كافٍ للتحليل الدقيق لصور المجهر البؤري (confocal microscopy).