生成可控的动态化学环境以研究微生物行为

该方法可用于阐明微生物在动态化学梯度中移动时的微尺度生态学特征与行为，揭示其在生态学相关微环境中的隐性权衡、营养动力学及种群动态。通过将微流控技术与光解作用相结合，我们可生成受控的化学脉冲，使局部化学引诱物在微尺度上突然释放，从而测量微生物种群在首次暴露于非稳态化学梯度时的趋化反应。使用计算机辅助设计（CAD）软件设计通道结构，并将其打印至透明胶片上以制作光刻掩模。

根据手稿在洁净室中通过软光刻技术制备母版。在40毫升烧杯中，按10:1的比例将弹性体与其固化剂混合，制备PDMS混合物。使用塑料刮刀充分搅拌，直至液体均匀。

立即将PDMS混合物置于室温下的真空腔中脱气45分钟。为加快脱气进程，可周期性释放真空，以破裂在界面处形成的气泡。使用加压清洁器清除母模表面的灰尘。

然后将脱气后的PDMS混合物倒入模具上，在80摄氏度的烘箱中烘烤两小时。用刀片在距离微结构约五毫米处切割PDMS，然后小心地将PDMS从模具上剥离。打孔以作为微通道的入口和出口。

用胶带密封微通道，以防止灰尘积聚。使用3D设计软件设计三维形状，并用高分辨率3D打印机打印PDMS模具的母模。按照之前的方法制备并脱气PDMS混合物后，用胶带轻拍母模表面以清洁之。

将模具放在天平上。然后，避开模具的中央区域，倒入23.4克未固化的PDMS混合物，使PDMS高度达到0.5毫米，与模具高度一致。使用压缩空气去除残留的气泡。

将PDMS铸型置于模具上，放入45摄氏度的烘箱中至少烘烤12小时。随后，轻轻剥离固化的PDMS层，并打孔作为进样口和出样口，用于注入细菌悬液。用氧气等离子体分别对培养皿表面和PDMS模具表面处理两分钟以进行活化。

通过轻轻按压将PDMS模具键合到培养皿上，避免按压模具特征结构所在区域。将键合有PDMS三维模具的培养皿置于45摄氏度的烘箱中，至少加热12小时，以增强化学键合强度。

接下来，在室温下将纳米多孔聚碳酸酯膜置于氧气等离子体腔中活化一分钟。在化学通风橱内，使用聚丙烯管将市售的3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液用去离子水稀释至体积比1%。将稀释后的3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液转移至培养皿中，并将活化后的膜浸入该溶液中反应20分钟。

然后，用镊子将膜从3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液中取出，放置在洁净室擦拭纸上晾干。为了制备将位于膜上并用于清洗细菌区域的PDMS微流控通道，请重复此前进行单化学脉冲实验时的微流控装置制备步骤。将PDMS清洗通道与功能化膜键合时，首先将PDMS清洗通道和聚碳酸酯膜在氧气等离子体腔体中处理两分钟以进行活化。

等离子体处理后立即轻轻按压PDMS清洗通道使其与功能化膜接触。务必轻柔地将PDMS与膜压合，否则膜可能会不可逆地粘附到200微米高PDMS微通道的顶部。随后，将已键合的PDMS清洗通道-聚碳酸酯膜层压结构以及先前键合到培养皿上的3D PDMS模具一同放入氧气等离子体腔室中处理两分钟，以进行活化。

将膜夹在两层PDMS之间并压合。将键合好的培养皿置于45摄氏度的烘箱中至少12小时，以增强化学键合。开始时，将微流控腔室置于真空条件下20分钟。

然后，将含有微流控腔室的培养皿放置在显微镜载物台上。使用移液器，通过膜下方的入口向腔室内加入稀释的细菌悬液，该悬液为含GFP荧光的鱼肠道败血症弧菌（Vibrio ordalii）悬浮于人工海水中、并含有1毫摩尔浓度的4-甲氧基-7-硝基吲哚啉基笼锁-L-谷氨酸（4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged-L-glutamate）溶液。在用细菌悬液充满通道后，用纸巾吸去多余的液体，并通过轻轻按压将PDMS塞子插入孔中，密封入口和出口。

用含1毫摩尔4-甲氧基-7-硝基吲哚啉基笼锁-L-谷氨酸的人工海水溶液填充注射器，并将管路连接至膜上方灌流通道的入口和出口。将管路连接至废液储液罐，并确保管路完全浸没在液体废液储液罐中，以避免压力振荡。将注射泵的流速设置为50微升每分钟。

启动注射泵，使膜上方的洗涤通道建立流动。启动控制LED光束和显微镜载物台的软件，并在不同位置以不同强度生成用户自定义的脉冲序列。使用4倍物镜，在数小时内定期以固定时间间隔记录视频，并覆盖多个相邻位置，以观察较大区域。

本研究中，采用微流控和毫流控装置研究细菌在动态营养条件下的趋化反应及聚集特征。最大强度投影显示了脉冲释放后0.5秒内以及脉冲释放后40秒时细菌的位置，细菌位置以白色轨迹表示。脉冲释放60秒后，细菌的运动轨迹以黑色显示。

阴影区域表示在视野中心于零秒时通过光解作用释放的化学脉冲，随后该脉冲发生扩散。此处展示了细菌浓度以及在视野中心释放脉冲后径向漂移速度的时间动态变化。漂移速度的负值对应于朝向脉冲中心的定向趋化运动。

此处展示了在无化学梯度条件下细菌群体的游动统计结果。轨迹表示细菌在微通道中三维运动的二维投影。测得的细菌游动速度概率分布通过伽马分布进行拟合。

从细菌的运动轨迹中提取了连续重新定向之间时间的概率分布。利用生物体的重新定向模式、游动速度分布以及重新定向统计特征，构建了一个基于个体的模型。该方法已在海洋细菌 Vibrio ordalii 向氨基酸谷氨酸进行趋化运动的实验中得到验证，但所提出的方法可广泛适用于不同物种与趋化物的组合，以及更广泛的生物学过程，例如在空间异质且动态变化条件下种群与群落的动态研究。

在微生物生态学和微生物学中，传统的技术（如分批培养或恒化器培养）在很大程度上忽略了微生物生境的空间-时间特征。通过光解在微尺度上近乎瞬时地产生化学脉冲，旨在模拟海洋细菌在自然环境中从多种来源遇到的营养脉冲类型，例如下沉有机颗粒后方羽流的扩散，或裂解的浮游植物细胞释放的营养物质扩散。氨基硅烷溶液具有强烈毒性，必须极其小心地操作和处理。

我们仅在通风橱内操作，并穿戴实验服、护目镜和手套等防护装备。同时，我们也会妥善处理所产生的废弃物。