单细胞解离 秀丽隐杆线虫一种分离活细胞的方法

- 取 已 洗涤 并 离心 沉淀 的 线虫 ， 加入 SDS （ 一种去污剂 ） 和 DTT （ 一种还原剂 ） 的 裂解 缓 冲液 。该步骤可破坏线虫的保护性角质层 ， 暴露虫体 以 便 于 细胞 解离 。避免线虫长时间接触裂解缓冲液 ， 以 尽 可 能 减少细胞裂解和死亡 。 。 。 。 。 。

接下来， 移除 的 裂解 试剂 与 若干 洗涤 的 冷 分离 缓冲液 它 是 重要 那 这 缓冲液 是 的 的 正确 渗透压 到 防止 细胞 死亡 使用 a 蛋白酶 酶 到 分解 细胞 到 细胞 连接。 帮助 的 匀浆化 过程 沿着 与 机械的 能量 由 移液 的 混合物 对抗 的 管 壁

添加 培养基 含有 血清 到 停止 的 酶 反应 和 抗生素 到 防止 污染。 沉淀物 和 洗涤 的 样本 若干 次数 至 移除 最 的 的 碎片

最后， 位置 的 管 在 冰 到 允许 用于 重力 沉降 碎片 包括 残留物 的 的 角质层 或 细胞 团块 将 沉淀 出 而 解离的 细胞 保持 悬浮 在 的 顶部 层 的 培养基 这些 细胞 能 是 使用 用于 短 术语 培养 或 到 分离 特异的 细胞 种群 由 FACS 或 免疫沉淀

在 本 示例 方案中，我们 将 分离 转基因 线虫，这些 线虫 在 特定 感兴趣 的 神经元 中 表达 GFP，以分离并分析这些细胞。

- 之后 收集 的 动物， 离心机 他们 在 1,600 次 g 用于 五 分钟 移除 全部 的 的 上清液 和 重悬 的 线虫 在 1 毫升 的 M9 培养基 转移 的 悬浮液 到 a 1.5毫升 微型离心机 管

离心 在 1,600 次 g 用于 五 分钟 到 沉淀物 的 线虫 然后， 添加 200 微升 的 SDS-DDT 缓冲液 和 孵育 在 房间 温度 用于 五 分钟 这 线虫 应该 现在 出现 到 是 皱褶的 沿 的 身体 如果 观察到 下 a 光 显微镜

接下来， 添加 800 微升 的 冰冷的 分离 缓冲液 和 混合 由 轻柔地 轻弹 的 管 离心 在 13,000 次 g 和 在 4 度 摄氏度 用于 一 分钟 到 沉淀物 的 线虫 移除 的 上清液 和 洗涤 与 1 毫升 的 分离 缓冲液

重复 这 离心 和 洗涤 过程 a 总计 的 五 次 制作 当然 到 仔细地 移除 的 分离 缓冲液 每个 时间。 之后 此， 添加 100 微升 的 蛋白酶 混合物 从 链霉菌属 griseus 溶解 在 分离 缓冲液， 到 的 沉淀物

孵育 在 室 温度 用于 10 到 15 分钟 制作 当然 到 应用 机械 破坏 由 移液 向上 和 向下 60 到 70 次 与 的 200 微升 微量移液器 尖端 对抗 的 底部 的 的 管 至 确定 的 阶段 的 消化 移除 1 到 5 微升 的 的 消化 混合物, 滴 它 到……上 a 玻璃 载玻片 和 检查 它 使用 a 组织 培养 显微镜

之后 五 到 七 分钟 蠕虫 片段 应该 有 a 明显地 降低的 角质层 和 a 浆液 的 细胞 将 是 易于 可见。 停止 的 反应 由 添加 900 微升 的 商业化 可获取的 Leibovitz氏培养基 L15 培养基 补充 与 10% FBS 和 青霉素-链霉素

离心 在 10,000 次 g 和 在 4 度 摄氏度 用于 5 分钟 至 沉淀物 分离的 片段 和 细胞 洗涤 的 沉淀的 细胞 两次 更多 与 冷 L15 补充 培养基 使用 1 毫升 的 培养基 每 洗涤。 重悬 的 沉淀的 细胞 在 1 毫升 的 L15 补充 培养基 和 离开 开启 冰 用于 30 分钟

然后， 取 上 层 液 约 700 至 800 µL ， 转移 至 一 个 微 离 心 管 中 。 使 用 自 动 细 胞 计 数 仪 或 血 球 计 数 板 对 10 至 25 µL 分离细胞的细胞密度进行测定。