用于好氧真菌控制植物组织分解的琼脂块微宇宙系统

本实验的总体目标是在培养皿微宇宙系统中接种一种好氧性木材降解真菌，并严格控制木材含水量及外源底物。该目标通过以下步骤实现：首先，制备含有精确体积已知培养基的微宇宙系统；随后，将待降解的木材以及任何外源性固体底物放置在培养基表面的塑料网格上，确保各底物之间不发生接触。

随后将微宇宙接种并用测试真菌进行培养。培养结束后，收获木块以测定质量损失，并制备组织用于后续分析。最终可通过质量损失测定、菌丝形态观察以及靶向元素分析（如电感耦合等离子体光谱法）获得结果，从而揭示木材生物降解的程度以及外源性元素来源的作用。

您好，我叫 Brooke Jacobson，来自明尼苏达大学生物产品与生物系统工程系 Jonathan Schilling 博士的实验室。今天我们将向您展示一种利用培养皿作为微环境，用于好氧真菌分解植物组织的实验方法。我们实验室使用该方法研究真菌降解木质纤维素的机制。

木质纤维素是由木质素、纤维素和半纤维素组成的植物组织。我们最常研究的组织是木材。在螺旋钻块设计中，与技术性较低的方面相关的错误是最常见的失败原因，也是不同研究之间变异性的主要来源，因此通过视频形式发表我们的螺旋钻块装置设置具有重要价值。根据经验，我们知道该方法能够获得高质量且变异度低的结果。

那么我们开始吧。进行这些实验时，使用比普通培养皿深1厘米的培养皿，以增加微宇宙中木块上方的顶空空间。

开始微宇宙制备，为每个培养皿准备足量的培养基，每培养皿使用20毫升无钙无铁的培养基。在500毫升容量瓶中加入约400毫升去离子水，并添加补充成分，然后加入15克琼脂。使用预先配制的储备液向混合物中添加微量元素。

加入营养物质后，将容量瓶加水定容至500毫升刻度线。接着，将培养基转移至1000毫升锥形瓶中。在121摄氏度、16 PSI条件下高压灭菌20分钟。

注意每个烧瓶中的体积不要超过 500 毫升，以免在测试平板接种前琼脂凝固。高压灭菌后，让培养基冷却至触感不烫，以尽量减少冷凝。在这些实验中，控制水分至关重要，即水分含量（mc）。

超过80%将导致组织缺氧。通过抑制好氧真菌的降解作用并减少变异性来加以限制。冷却。使用便携式移液器辅助装置和10毫升无菌聚苯乙烯移液管进行无菌操作。

在生物安全柜中，将琼脂转移至一叠较高的培养皿中。接着，大量裁剪塑料网状格栅，使其能够贴合培养皿底部。裁剪后，用肥皂和水彻底清洗格栅，然后将格栅准备好进行干燥和高压灭菌，以用于本次演示。

南方黄松（SYP）因其是重要的木材来源而被采用。在美国的住宅建筑中，使用未经处理的木材，沿纹理方向进行单次纵向切割，制备19毫米×19毫米、无节的木块，再将该长度切割成19毫米见方的立方体木块。

使用凿子和锤子沿纹理将19立方毫米的木块一分为二，而不是使用锯子。这样可使木块形成一个粗糙的底面，用于朝下放置在农业区微宇宙系统的塑料网筛上，同时保留一个光滑的顶面用于标记。用铅笔在木块的光滑边缘进行标记，根据处理组需求切割足够数量的木块，同时包括未接种的对照组样本，这些对照组将用于污染监测，并作为与烘干样品平行处理的基线数据样本。将样本放入铝制沥水盘中，置于100°C的对流烘箱中干燥48小时。

将样品从烘箱转移至干燥器中冷却。冷却后，预先称量样品以确定初始烘干重量。最后，将样品（包括塑料网格和木材）用铝箔紧密包裹，以尽量减少湿气进入，为高压灭菌做准备。

这并不要求每个样品都单独包裹，但需确保蒸汽暴露程度低且一致。将标记好的样品在121摄氏度、16 PSI条件下高压灭菌1小时。在无菌生物安全柜中，准备好空的AEs、用于接种物的网状植物基质外源材料源板、记号笔、对苯二甲醛试纸条、镊子以及转移工具。

接种的下一步是将物品添加到培养基中，并用培养皿盛装以尽量减少污染风险。使用95%乙醇对转移工具和镊子进行火焰灭菌。首先，将塑料网格放入培养皿中。

然后在此处添加木基质。沿网格长度方向放置两块木块，以便配对早期和晚期收获的数据。这两块木块并排放置，木纹方向一致，并朝向真菌接种源的一端。

接下来，添加外源物质。此处旨在测试石膏对丝状真菌降解作用的影响。因此，真菌在接触到木材之前应先接触这些石膏圆片。

在网格上方的每个方块与接种点之间放置一片石膏圆片。操作时需注意避免木材中的圆片相互接触，同时保持它们彼此靠近。对于真菌接种物，使用直径为七毫米的4号打孔器，从在20毫升琼脂中培养两周的菌落上切取菌块。

这有助于控制接种量。对于未接种的对照组，最好添加来自无菌平板的菌块。注意不要让接种物与外源基质或木材接触，但应将它们放置在相近的位置。

每个方块使用一个接种块。用剃刀切割的封口膜将培养皿密封，保持培养皿水平，并以平滑连续的动作包裹封口膜。最后，使用耐酒精标记笔在培养皿盖上标记方块编号，直接对应各自的底物。

同时在石膏圆盘上画出圆圈。将培养皿小心转移至生物培养箱中，避免晃动内容物，并减少因温度波动而产生的冷凝。此处使用的培养条件为20摄氏度、避光培养，除最后一次收获外，其余时间点的系列收获均需无菌操作。

在第五周收获时，取出全部处理组样本。用70%乙醇喷洒每个培养皿的底部和顶部，并使用火焰灭菌的镊子在生物安全柜内取出材料。在销毁种植板之前拍照，重点拍摄任何形态F或甜瓜样本。

然后取出待处理的样品块。卷走多余的pha，但需小心避免丢失任何腐烂的材料。将样品块置于铝制舟皿中烘干，并利用对照组的新鲜重量和干重来测定质量损失，以监测是否存在过度毛细吸水现象。

质量损失数据有助于评估降解进程，是重要的实验数据。若需以克重为基础计算元素浓度，则必须对百分比数据进行归一化处理。进行统计时，应标记并追踪任何深棕色块状物，这些块状物明显处于水浸状态。

最后，将培养物置于可高压灭菌的袋中彻底销毁，保留塑料支撑网及其他可回收部件，以供未来实验重复使用。在农用块微环境装置中，松木块放置在塑料网上，使其高于农用基质表面。圆形克拉因氏菌直接在石膏表面生长，并侵入木块内部。

该菌丝体代表了木材与外源营养元素来源之间的重要连接。通过在琼脂或固体材料中控制这些外源物质来源，是农业块设计相较于土壤块设计的一个关键优势，以五周和十五周后松木在农业块微环境中的平均重量损失百分比作为衡量丝状真菌降解木材程度的指标。

未进行任何处理。在每次收获时，向琼脂中添加5毫摩尔氯化钙，并使用纯度大于99%的石膏或含1%铁的改良石膏。相同字母标注的柱状图之间无显著差异。误差线表示标准偏差，在对照组褐腐松木块中观察到超过60%的重量损失，符合美国材料与试验协会（ASTM）对腐朽程度大于50%的标准要求。

在第16周时，腐烂的变异系数平均为0.055。除了变异性较低外，还观察到了处理效应。无论以氯化钙形式添加至琼脂，还是以纯石膏形式添加，钙的加入均抑制了真菌腐烂。

有趣的是，在石膏中添加铁后，降解速率出现回升。这表明在第15周观察降解的五个重复样本时，起关键作用的是铁而非钙。在相同的褐腐试验真菌和环状层板条件下，菌丝的颜色揭示了其特征。

不同处理间外部菌丝的差异，移除区组并向上干燥。结果显示无钙处理中主要成分的缺失。纯钙处理中出现的黄化现象，以及添加铁处理中呈现的锈色外观。

对照组为未接种的样本块，用于比较。有趣的是，在高铁培养基中，主要效应消失。综合来看，这表明该真菌利用的是铁，而非钙。

在这些材料中，我们刚刚向您展示了如何使用螺旋钻块装置成功测试好氧丝状真菌对植物组织的生物降解。进行此操作时，重要的是要记住避免底物相互接触，尤其是植物组织与螺旋钻；应尽量减少螺旋钻和血小板中的水分含量，并在培养前仔细检查每个培养皿中的内容物是否发生位移。考虑到这些变量后，您对降解环境的控制将远优于使用土壤块装置时的情况。

您可以生成具有足够统计功效的数据，以回答您的研究问题。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。