iCLIP——全转录组范围内单核苷酸分辨率的蛋白质-RNA 相互作用图谱绘制

以下实验的总体目标是获得RNA结合蛋白在单个核苷酸分辨率下的全转录组结合位点图谱。该目标通过紫外照射活细胞实现，以在体内将蛋白质与RNA共价交联作为第二步。随后在严格条件下通过免疫纯化RNA结合蛋白，从而回收交联的RNA片段。

接下来，逆转录生成的cDNA通常会在连接的肽段处发生截短，从而保留RNA中交联位点的信息。通过对cDNA文库进行高通量测序，可以获得转录组内所有结合位点的结果。该方法有助于回答RNA生物学中的关键问题，例如不同RNA结合蛋白之间的相互作用如何调控RNA的加工过程。该技术的主要优势在于，我们提高了全转录组范围内蛋白质-RNA相互作用图谱的性能和分辨率。接下来开始进行紫外交联组织培养细胞的实验步骤。

从一个10厘米的愈合细胞培养皿中移除培养基。加入6毫升冰冻的磷酸盐缓冲液，并将培养皿置于冰上。一个培养皿足以进行三次实验。

取下盖子并照射细胞。在254纳米波长下以150毫焦耳/平方厘米照射后，用细胞刮刀将细胞从培养板上刮下，收集细胞。将两毫升细胞悬液分别转移至三个微量离心管中，以沉淀细胞。在4°C下以最高速度离心10秒。

然后去除上清液，将细胞沉淀在干冰上速冻，并于-80摄氏度保存备用。每个实验向新的微量离心管中加入100微升蛋白质及一份dyna磁珠。若使用小鼠或山羊来源的抗体，则应使用蛋白G dyna磁珠。

用裂解缓冲液洗涤磁珠两次，裂解缓冲液可在随附的书面实验方案中找到。将磁珠重悬于100微升裂解缓冲液中，加入2至10微克抗体。室温下旋转孵育管子30至60分钟。

然后用 900 µL 裂解缓冲液洗涤磁珠三次，最后一次洗涤后将磁珠保留在缓冲液中，直至准备进行下一步操作。将 Thor 细胞在冰上进行免疫沉淀。重悬于 1 mL 裂解缓冲液中，并转移至 1.5 mL 微量离心管中。

将RNA一进行1:500稀释。然后取10微升与2微升Turbo DNA酶一同加入细胞裂解液中。将样品在37摄氏度下准确孵育3分钟，以每分钟1,100转的速度振荡，随后立即转移至冰上。

然后在 4°C、22,000 × g 条件下离心样品 20 分钟，离心后小心收集上清液，留下约 50 微升裂解液与沉淀物，用于免疫沉淀珠。去除洗涤缓冲液，然后加入制备好的细胞裂解液。在 4°C 下旋转孵育样品 2 小时。

弃去 SUP 试剂，用 900 µL 高盐缓冲液将磁珠洗涤两次，高盐缓冲液的配方见随附的书面实验方案。最后用 900 µL 洗涤缓冲液将磁珠洗涤两次。随后进行去磷酸化反应，并在 RNA 的 3' 末端添加接头。

在聚甲基丙烯酸甲酯防护罩后操作，对RNA的5'端进行标记。除去接头连接反应最后一次洗涤的上清液，将磁珠重悬于8 µL热PNK混合液中。在37°C下孵育5分钟。

移除热的PNK混合物并重复使用。将磁珠悬浮于20 µL的1×新PAGE上样缓冲液中，然后在70 °C下于恒温混匀仪中孵育样品10分钟。

立即将样品置于磁铁上，以沉淀空珠。根据制造商的说明，将样品上样至4%至12%的Biss凝胶上。

同时，加入5 µL预染蛋白质分子量标记物。在180伏电压下电泳50分钟。使用NOVA湿转装置，按照制造商说明书将凝胶中的蛋白质-RNA复合物转移至硝酸纤维素膜上。

转膜后，用 PBS 缓冲液冲洗膜。然后用保鲜膜包裹，并在 -80 摄氏度下曝光至胶片。分别进行 30 分钟、1 小时和过夜曝光。

接下来，根据蛋白质-RNA复合物从低丰度RNA中分离膜区域。使用放射自显影图像作为模板进行实验。通过蛋白酶K消化和酚-氯仿抽提从膜上回收RNA。

使用 AYP 引物之一对 RNA 进行逆转录，以凝胶纯化 cDNA。将六微升 cDNA 样品与六微升两倍浓度的 TBE 尿素上样缓冲液混合。在将样品上样到凝胶之前立即进行此操作。

将样品在 80 摄氏度下加热 3 分钟。然后将样品与低分子量标记物一起上样至预制的 6% TBE 尿素凝胶中。按照制造商的说明，以 180 伏电压电泳运行 40 分钟，利用上层染料和塑料凝胶支架上的标记来指导切胶操作。

切取三条条带，分别为120至200个核苷酸、85至120个核苷酸以及70至85个核苷酸。请注意，arc lip引物和L3序列共同占CLIP序列的52个核苷酸。加入400微升TE缓冲液，并将凝胶切片碾碎成小块。

使用1毫升注射器活塞，将凝胶小块在37摄氏度下以每分钟1,100转的速度振荡孵育两小时。将两个1厘米的玻璃预滤器放入CoStar SpinX柱中。将样品的液体部分转移至该柱中，在13,000转/分钟的条件下离心一分钟，收集至1.5毫升离心管中。

加入0.5 µL甘油蓝和40 µL pH 5.5的乙酸钠。然后混匀样品。加入1 mL 100%乙醇。

再次混匀，并在 -20 摄氏度下沉淀样品过夜。最后，将 cDNA 分子环化，使接头区域连接至 5' 末端。接着，重新线性化并根据随附的书面实验方案进行 PCR 扩增，在对眼夹文库进行测序之前，实验的成功可在两个步骤中进行监测。

在膜转移后，低RNA样品的蛋白-RNA复合物自显影图中，PCR产物的凝胶图像显示放射性信号应弥散分布在蛋白分子量以上的区域；而对于高RNA样品，该放射性信号则更集中于接近蛋白分子量的位置。在免疫沉淀过程中若未使用抗体，则不应检测到任何信号。

为进一步验证免疫沉淀的特异性，还需设置其他重要对照，例如使用发射UVE辐射的光源，或采用不表达目标蛋白的细胞。PCR产物的凝胶图像应显示出与cDNA片段相对应的大小范围。需要注意的是，PCR引物P3 Celexa和P5 Celexa会在cDNA片段的基础上额外引入76个核苷酸。若在免疫沉淀过程中未使用抗体，则不应检测到相应的PCR产物。

在进行该实验操作时，重要的是要牢记，64个步骤中的每一步都至关重要，必须以百分之百的准确性执行。ICL数据可与转录组范围的功能分析进行计算整合。例如，这种方法有助于深入了解RNA加工过程中依赖于位置的调控机制。

对于计算数据分析，我们建议参考我们近期与欧洲生物信息学研究所的 Nicholas KA 以及利雅那大学的 bla zupan 合作发表的论文。现在是您开始自己实验的时候了。祝您实验愉快。