小鼠睾丸中高效鉴定蛋白结合RNA的增强型交联免疫沉淀（eCLIP）方法

RNA结合蛋白对细胞生理功能至关重要。尤为重要的是，RNA结合蛋白在精子发生过程中高度表达，并已被充分证实为在生殖细胞各个阶段发挥关键作用的转录后调控因子。鉴定其结合靶标对于阐明RNA结合蛋白的作用机制具有重要意义。

本方案代表了eCLIP方法的一种改进应用，用于捕获内源性直接RNA靶标，并为在哺乳动物睾丸中开展eCLIP实验建立了可行的基础。该方法的主要优势在于无需使用放射性标记、耗时较短，并且由于使用大小匹配的输入样本作为背景对照，可获得更高的信噪比。最后，我们认为在深度测序之前进行小规模的亚克隆测序是有益的。

演示该实验步骤的是我的同事Xu Qiushi。开始实验时，为每项免疫沉淀实验采集适量年龄小鼠的睾丸组织约100毫克。将组织置于预冷的PBS中。

使用一对尖头镊子，轻轻去除白膜。向组织研磨器中加入三毫升冰浴 PBS，用松散的玻璃研杵通过温和的机械力将组织反复吹打。接着，将组织悬液转移至细胞培养皿中，并加入冰浴 PBS 至六毫升。

快速振荡培养板，使液体均匀覆盖皿底。在冰上用254纳米波长、400毫焦/平方厘米的剂量对悬液进行三次交联。每次照射之间务必混匀悬液。

然后，将悬液收集到15毫升的锥形管中，在4°C、1,200 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于1毫升PBS中。随后，将悬液转移至1.5毫升离心管中。

在 1,000 × g、4 °C 条件下离心两分钟，弃去上清液。首先，向一个洁净的离心管中每份样品加入 125 µL 蛋白 A 磁珠。将离心管置于磁力架上，使磁珠与溶液分离。

10 秒后，去除上清液，并用 1 毫升冰预冷的裂解缓冲液将磁珠洗涤两次。将磁珠重悬于含有 10 微克 eCLIP 抗体的 100 微升冷裂解缓冲液中。室温下旋转孵育管子 45 分钟。

然后，用一毫升预冷的裂解缓冲液将磁珠洗涤两次。首先，将组织沉淀重悬于一毫升含有22微升50倍浓度无EDTA蛋白酶抑制剂混合物和11微升RNase抑制剂的预冷裂解缓冲液中。将样品置于冰上继续裂解15分钟。

按照文本方案中所述，对每个样品进行超声处理。随后，向每根试管中加入4 µL DNase，并充分混匀。在37 °C条件下孵育10分钟，同时以1,200 rpm振荡。

此后，加入10 µL稀释的RNase并充分混匀。在37 °C下以1,200 rpm振荡孵育5分钟。然后，在4 °C下以15,000 ×g离心20分钟，以澄清裂解液。

小心收集上清液，并为RWB和RRI样品保留输入样品。首先，将一毫升裂解液加入已准备好的磁珠中，在4°C下旋转孵育两小时或过夜。随后，将样品置于磁力架上收集磁珠，并弃去上清液。

用900微升高盐缓冲液将珠子洗涤两次，然后用900微升洗涤缓冲液再洗涤两次。接着，用500微升1×去磷酸化缓冲液洗涤珠子一次。首先弃去上清液，并使用细尖移液吸头去除任何残留液体。

向每个样品中加入25 µL三端连接主混合液，用移液器轻轻吹打混匀。向每个样品中加入2.5 µL RNA接头X1A和2.5 µL RNA接头X1B。通过移液或轻弹管壁充分混匀。

在25摄氏度下孵育75分钟，每隔10分钟轻轻振荡管子以混匀。用500 µL冷洗涤缓冲液洗涤磁珠一次。接着，用500 µL冷高盐缓冲液洗涤磁珠一次，然后再用500 µL冷洗涤缓冲液洗涤一次。

将上述两次洗涤步骤各重复一次。使用磁力架分离磁珠，并用细尖移液枪头吸除残留液体。将磁珠重悬于100 µL预冷的洗涤缓冲液中，取20 µL转移至新的离心管中作为RWB样品。

向剩余样品中加入 7.5 微升 4x LDS 上样缓冲液和 3 微升 10x 样品还原剂。在 70 摄氏度下孵育 10 分钟，同时以 1,200 转/分钟振荡。孵育结束后，将样品置于冰上冷却 1 分钟，然后在 4 摄氏度下以 1,000 × g 离心 1 分钟。

对于RWB凝胶，将试管置于磁力架上，使蛋白洗脱液与磁珠分离。每个加样孔中加入15微升样品。接着，将500微升抗氧化剂加入500毫升1x SDS电泳缓冲液中。

以200伏电压在1×SDS电泳缓冲液中电泳50分钟，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。在含有10%甲醇的1×转膜缓冲液中，以10伏电压将凝胶中的蛋白质-RNA复合物转移至硝酸纤维素膜上，转膜时间为70分钟。用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭RWB膜1小时。

用 TBST 洗涤膜，然后在 TBST 中加入一抗，4 摄氏度孵育过夜。之后用 TBST 洗涤两次，每次洗涤持续 5 分钟。再在 TBST 中加入二抗，室温孵育 1 小时。

然后，用 TBST 将膜洗涤三次。接着，将等体积的 ECL 缓冲液 A 与缓冲液 B 混合。将此混合液加入膜上，孵育一分钟。用塑料膜覆盖膜，并在室温下曝光于 X 射线胶片 2 至 3 分钟，随后显影胶片。

本研究中，对成年野生型小鼠睾丸进行 MOV10 eCLIP 实验，使用 RNase I 处理交联裂解液，成功富集了分子量约为 114 千道尔顿的目标蛋白。对不同样本的 cDNA 进行 1:10 稀释后的 qPCR 结果显示，未交联样本的 RNA 回收率降低。观察发现，未交联组的 Ct 值通常比紫外交联组高出约五倍。

此处展示了通过琼脂糖凝胶电泳进行 PCR 扩增和大小筛选的代表性结果。引物二聚体产物出现在约 140 个碱基对处。两个代表性亚克隆序列的 UCSC 基因组浏览器视图显示，与 MOV10 结合的 eCLIP 标签位于 Fto 基因的三端非翻译区（3′ UTR）内。

3'非翻译区靶标的近似比例占75%，这与在HEK293细胞和睾丸中大多数MOV10靶标的研究结果一致。相比之下，MOV10L1结合的eCLIP标签被发现定位于piRNA簇内，表明MOV10L1靶向piRNA前体。piRNA前体靶标的近似比例占42%，这一结果反映了既往研究中观察到的趋势。

使用40单位/毫升RNase I消化进行MOV10L1 eCLIP，可获得相对较多多于20个碱基对的序列。本文所述方案代表了eCLIP方法在生殖领域中的应用，该领域中关于RNA-蛋白质相互作用的知识仍较为匮乏。