使用Helios基因枪在洋葱细胞中进行蛋白质-蛋白质相互作用的双分子荧光互补（BiFC）检测

该实验通过体内蛋白质-蛋白质相互作用检测方法，研究拟南芥中两种转录调控因子SEU（spelled SEU，简称SEU）与LUH（lu holog，简称LUH）之间的相互作用。利用双分子荧光互补技术，将SEU与黄色荧光蛋白（YFP）的N端片段融合，LUH与黄色荧光蛋白（YFP）的C端片段融合，构建两种质粒载体：SEU-NYFP 和 LUH-CYFP。随后将这两种质粒通过基因枪轰击法导入洋葱表皮细胞，以检测二者是否存在相互作用。

Seuss 与 LUH 之间的相互作用导致 YFP 的末端片段和 C 端片段在细胞核内结合，从而在细胞核中产生 YFP 荧光。在黑暗条件下孵育 16 至 20 小时后，利用荧光显微镜观察洋葱表皮组织，以检测荧光信号。大家好，我是 Courtney Hollander，来自马里兰大学细胞生物学与分子遗传学系 Zhi Lu 博士的实验室。

今天，我们将向您展示一种利用伯乐公司Helios基因枪在洋葱细胞中检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法。我们实验室使用该方法来检测植物细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质定位。现在让我们开始吧。

开始本实验前，按照 Woods 和 Zeto 2008 年在 JoVE 视频协议中详细演示的步骤，为 Helios 基因枪准备载弹。在 BIFC 实验中，将 50 微克总质粒 DNA 与 12.5 毫克金颗粒以及 0.5 毫克/毫升的 PVP 溶液混合。采用相同的载弹制备方法，将两种质粒 DNA 分别用于疑似相互作用蛋白的表达：Seuss 蛋白与 YFP 的 N 端半段融合，简称为 seus-NYFP；LU 同源蛋白与 YFP 的 C 端半段融合，简称为 L-U-H-C-Y-F-P。

总用量为每次制备50微克，可制备最多50个金粉载体，每个载体含1微克DNA和0.25毫克金粉。每个载体仅用于一次轰击。载体制备完成后，需对载体进行测试，以确定金颗粒是否能被有效驱动。

将一块方形的帕拉膜包裹在培养皿上。然后将氦气压力设置在150至200 PSI之间，将新制备的弹药发射到帕拉膜方块上。观察帕拉膜上微弱的金颗粒。

不同数量的金颗粒可能在不同的氦气压力下被轰击到样品上。然而，如果差异不显著，则应选择较低的压力进行轰击。该测试还可指示每次射击所覆盖的区域。

为制备洋葱组织，使用洁净且锋利的剃须刀片从一个大型黄洋葱上剥下外层表皮。切取一块 2 × 8 厘米的矩形区域，深度为四到五层细胞。取出该矩形洋葱组织，并弃去最外层的两层。

将洋葱的剩余部分切成约1.5厘米见方的小块。将洋葱小块放入含有直径为3毫米滤纸圆片的培养皿中。用无菌水润湿后，盖上培养皿盖。

洋葱组织块已准备好进行轰击。首先，将弹匣装入白色的圆形弹匣架中，将含有不同质粒构建物的弹匣分别装入不同的弹匣架。每个弹匣架最多可容纳12个弹匣，用于12次射击。

此处加载了三种不同的载体。第一种载体含有质粒，该质粒包含来自花椰菜花叶病毒的 35 S-G-F-P-A 强且组成型启动子。该质粒作为阳性对照。

第二个支架装载了含有等量 S-E-U-N-Y-F-P 和 L-U-H-C-Y-F-P 的实验用弹夹。第三个弹夹支架装载了含有等摩尔混合的puck spine载体和LUH puck spice的弹夹。这同时也作为阴性对照。

将电池和新的筒衬插入 Helios 基因枪中。确保筒衬和基因枪上均装有各自的 O 形圈。接下来，将一个空的载样卡匣架插入基因枪中，使卡匣架上标号为 12 的标记朝向枪的顶部。

推动基因枪的弹夹座一到两次，以确保其已正确插入。然后将基因枪连接至氦气瓶，并将压力调节至150至200 psi之间。我佩戴听力保护装置，通过按住侧边按钮并扣动扳机的方式试射几次。使用空的弹夹座试射，可清洁基因枪的枪膛，并确保压力稳定。

在轰击DNA之前，可先轰击一片洋葱作为阴性对照，以检测背景荧光。要轰击包裹DNA的金颗粒，需取出空的弹夹架，插入装有阳性对照的第一支加载好的弹夹架。推进弹夹架，使准备发射的弹夹位于弹夹架底部位置。

现在将洋葱片放置在空培养皿中央，使洋葱的最内层朝上。将基因枪的套管衬垫靠在培养皿上，然后发射基因枪。推进至下一个弹匣，对另一片洋葱进行射击。

重复此步骤，直至射击四到五个洋葱片。每个洋葱片在射击后仅使用一次。将轰击后的洋葱片转移至含有湿润的3 mm滤纸的培养皿中，以射击实验用弹药。

更换为卡式弹药 Holden。编号二，记得更换枪管衬管以防止污染。射击四到五个洋葱片，操作方式如刚才所示的阳性对照。

然后更换为含有阴性对照 DNA 的三号弹夹（Holden）。再次轰击四到五个洋葱片。

更换枪膛衬管以防止污染。轰击后，用盖子盖住含有洋葱片的培养皿。

用对二氯苯包裹以防止干燥。将洋葱片置于室温避光条件下孵育16至48小时。基因枪轰击完成后，先关闭气体，释放压力，再将基因枪从氦气罐上取下，拧开枪管衬套，取出弹匣架和已使用的弹匣。

最后，将墨盒架和枪管衬套浸入装有肥皂水的烧杯中，超声处理 20 分钟。随后用清水冲洗，以去除所有肥皂残留物。

用70%乙醇浸泡一小时，然后在纸巾上晾干。在轰击后16至20小时进行洋葱片的观察。将轰击后的洋葱片在室温下孵育16至20小时后，使用平头镊子缓慢剥离洋葱内表皮的单层细胞。

这是在轰击过程中直接面向基因枪的一层。将去皮后的组织层放置在载玻片上的一滴水中，并盖上盖玻片。注意尽量减少气泡的产生。

使用荧光显微镜（例如此处所示的zes axio observer，在显微镜明场下观察点Z一）观察GFP或YFP荧光。首先检查细胞质流动，以确认细胞存活。为此。

将载玻片暴露在明场光下几分钟，以使洋葱组织升温，然后寻找流动的细胞质。胞质流动并不总是容易观察到，因此如果无法清晰看到，也不要气馁。进行荧光检测时，请使用适合GFP或YFP的激发和检测滤光片。同时检查阴性对照，即用非荧光质粒轰击的洋葱组织块。

受伤的细胞、碎片和洋葱可能会出现微弱的黄色信号。同时，检查阳性对照。该质粒含有组成型表达的荧光报告基因。

部分细胞中可见 GFP 荧光，但并非所有细胞均可见。气泡也可能产生背景荧光。洋葱表皮细胞中观察到的可见 GFP 信号表明，基因枪弹、洋葱组织以及基因枪轰击操作均已正确制备并成功执行。

图中显示了来自 35 SGFP 阳性质粒的强烈荧光。整个细胞，包括细胞核和细胞质，均可见强烈荧光。明场图像可使观察者看到细胞和细胞核的相应轮廓。

并非所有细胞都会被转化。当将实验组合Seuss、NYFP和L-U-H-C-Y-F-P轰击入洋葱细胞时，可在洋葱细胞核中检测到YFP荧光信号，表明Seuss、NYFP和L-U-H-C-Y-F-P在体内发生了相互作用。然而，这种由相互作用介导的荧光信号显著弱于阳性对照中35S-GFP介导的荧光信号。

此外，SEUS 和 LUH 转录因子定位于细胞核内，因此 YFP 荧光仅在细胞核中观察到。并且，荧光细胞的数量显著低于 35 SGFP 阳性对照。

这是因为B FFC只有在两种伴侣质粒于同一洋葱细胞中表达时才能发挥作用。在用包含puck spine载体和L-U-H-C-Y-F-P的第三号卡匣载体轰击的洋葱中，未检测到荧光信号，这符合阴性对照的预期结果。我们刚刚向您展示了如何利用BioRad Helios基因枪系统轰击洋葱细胞，以检测蛋白质-蛋白质相互作用。

进行此实验操作时，重要的是要记得使用适当的阳性和阴性对照，并了解双分子荧光互补（BIFC）的荧光信号可能较弱，且荧光细胞数量较少。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。