测量芽殖酵母的复制寿命

芽殖酵母 Croce Visi 已被广泛用于研究衰老生物学。在本文中，我们介绍了一种测定酵母母细胞复制寿命的通用实验方案。大家好，我是来自华盛顿大学生物化学系 Brian Kennedy 实验室的 Kristen Steffen。

今天我们将向您展示一种测量酵母母细胞复制寿命的实验方法。我们在实验室中使用该方法来研究影响酵母细胞寿命的基因。现在，让我们开始吧。

对于复制性寿命实验以及寿命分析用酵母细胞的制备，需要制备固体YEPD平板。请使用适当的无菌技术制备这些YEPD琼脂平板。每个寿命实验中待分析的四到五个菌株，至少需准备两个平板。

这些平板至少应在寿命实验开始前两天制备，并在开始寿命测定前使其干燥。如果实验无法在倒板后四到五天内进行，则应使用封口膜或塑料膜包裹，并置于冷藏培养箱中，以防止干燥。从冷冻保藏菌种中取出酵母菌株，划线分离单菌落。

接种到 YEPD 琼脂平板上。通过将平板均分为若干等大的扇形区域，同一块 YEPD 平板上可轻松划线接种多达六种菌株。将细胞在 30 摄氏度下培养两天。

孵育结束后，从培养箱中取出细胞，并将单个菌落的细胞转接到新鲜的 YEPD 平板上。此时应对待分析的菌株进行标记，以确保复制性寿命实验的盲法操作，即解剖人员不知道各个菌株的身份。链状结构。

接下来，将已划线的包被细胞在30摄氏度下孵育至次日晚上。取出细胞后，将每种包被菌株的细胞轻轻划线转接到新鲜的YEPD平板上。这些平板将作为用于复制性寿命实验的实验平板。

应在YEPD平板左侧沿一条垂直线进行点种分析细胞。不要将过多细胞转移到单个新鲜YEPD平板上，因为这会导致细胞在过夜培养期间生长过密，从而影响其复制寿命，每块平板上点种约三至五个区域为宜。

假设将对每个菌 patch 中的 20 个细胞进行复制性寿命分析，目前寿命实验已全部准备就绪，接下来只需在实验台面上过夜培养即可。明天我们便可开始显微解剖操作，将酵母细胞定位在培养皿上，并获取新生的女儿细胞，用于复制性寿命分析。

使用配备有适用于酵母的显微解剖装置的显微镜。从第一个菌株斑块中转移约50个细胞至培养皿上距离原有斑块较远的位置。如果显微镜载物台带有刻度，可利用这些刻度确保在后续操作中易于找到细胞。

有时细胞可能会卡在针头中，如果在错误的时间释放出来，可能会造成问题。为确保针头清洁且无细胞残留，请反复将针头接触琼脂表面。然后通过用力将针头穿过琼脂表面来在琼脂中打孔。

此孔将作为标记，用于在后续解剖和点样细胞去除过程中确定培养板上的方位。注意避免将酵母细胞落入孔中，否则它们会生长并在孔正上方形成菌落。用一根细针将单个酵母细胞垂直排列成20个等距位置，每个细胞位置之间间隔一到三个针的直径。

每隔几个细胞，在同一条线的相同位置并排放置两个细胞，而不是一个细胞。这样可以在挑选未交配子代细胞时提供冗余性。如果其中一个被转移的细胞在第10和第11个位置之间未能分裂，则在琼脂上创建一排由7到8个孔组成的水平序列。

这将作为后续解剖和去除子细胞过程中在平板上定位的标记。再次注意，避免将酵母细胞落入孔中，否则它们会生长并形成菌落。对平板上的每个菌斑重复此操作，继续沿同一轴线垂直排列细胞。

需要注意的是，在AER上打孔时，所打孔的数量应与补片编号相对应，即第一个补片对应一个孔，第二个补片对应两个孔。每个补片的细胞排列完成后，用封口膜密封培养板，并在30摄氏度下孵育约两小时。请记住，从此时起，所有培养板均应使用封口膜密封，仅在进行解剖操作时方可打开。

为防止干燥，需对每块培养板重复此操作步骤。在实验中，进行寿命分析时，必须确保每个细胞均起始于一个未交配的子代细胞。

首先，将培养板从培养箱中取出，并确认大部分阵列细胞已完成细胞分裂。此处展示的是先前已排列好的细胞，可以看出，在培养箱中培养两小时后，它们已经开始分裂。现在我们得到了一个母细胞（即较大的细胞）及其附着在其上的新生子代细胞（即处女子细胞），该处女子细胞将用于起始寿命分析。

如果需要额外时间以完成细胞分裂，请将培养板放回培养箱。从第一个阵列细胞开始，用针轻轻压在贴壁细胞上方，将子细胞从母细胞上分离。

当针头接触细胞时，轻敲显微镜底座侧面有时会有所帮助。接下来，将分离的子细胞放置到细胞垂直排列的位置，替换母细胞及任何其他子细胞，并暂时将其余细胞移至一旁。对每个阵列细胞重复上述步骤。

如果某个细胞未能分裂，则从位于待测细胞旁边的冗余细胞中取一个子代细胞。完成操作后，每个区域应垂直排列有20个子代细胞。将所有母细胞和多余的子代细胞收集到一堆中，并转移回靠近区域附近的一个称为“墓地”（graveyard）的区域。

为防止形成微菌落和局部营养耗尽，必须将不需要的细胞与正在进行寿命分析的细胞保持较远距离。细胞分离后，从平板上移除并置于30摄氏度下孵育约两小时。对实验中的每一块平板重复上述步骤。

为了测量单个细胞的复制能力，您需要准备寿命数据表。寿命数据表可以是一个简单的网格，其中每一行对应一个单独的母细胞，每一列对应一个年龄时间点。请根据待分析菌株的数量对每张数据表进行标注。

首先，从培养箱中取出培养板，检查大部分阵列细胞是否已完成至少一次细胞分裂。若需更多时间以完成细胞分裂，应将培养板重新放回培养箱中。从第一块板上的第一个阵列细胞开始，通过显微观察母细胞和子细胞，判断已发生的细胞分裂次数。

通常，根据细胞排列的特征性模式，可以很容易地确定一个母细胞产生了多少个子代细胞。这个例子中很容易看出母细胞产生了多少个子代细胞，因为这里有两个细胞，它们大小相同，且都比母细胞小。在寿命评分表的相应位置记录母细胞产生的子代细胞数量。

接下来，使用针头将子代细胞从母细胞上分离，具体操作方法如下：将针头轻轻置于附着的细胞上方，同时轻敲显微镜底座侧面，使针头在细胞上产生轻微震动。保持母细胞在垂直线上位置不变，将子代细胞暂时移开。对阵列中的每个细胞重复上述步骤。

最后收集所有弃去的子代细胞，并将其转移至靠近原始菌落的墓地区域。用封口膜封住培养板，于30摄氏度孵育2至3小时。重复弃去子代细胞及孵育步骤。

对实验中的每一块平板执行此步骤。重复整个操作过程，直至所有母细胞停止分裂。需要注意的是，随着母细胞老化，细胞周期进程会变慢，因此在后续的不同年龄时间点之间，建议将平板孵育更长时间。之后，可将平板在4°C下过夜保存。

复制性寿命实验产生的原始数据是一组数字列表，对应每个母细胞在各个年龄时间点所产生的子代细胞数量，如此处所示。通过将记分表中每一行的数值相加，即可得到每个母细胞的复制性寿命。

可将同一实验组中其他细胞的数据合并，以生成生存曲线并进行统计学计算。该曲线应大致符合Gompertz-Makeham动力学特征，呈现为具有较低早期死亡率、随后生存率相对较快下降、并在较晚年龄时曲线趋于平缓的S形曲线。我们刚刚向您展示了如何开展酵母复制性寿命实验。

进行此操作时，重要的是要记住，细胞在非低温环境下会持续分裂。因此，请记得将培养板在4°C下过夜放置，以免第二天早晨出现过多子代细胞而难以计数。就是这样。

感谢观看，祝您的实验顺利。