使用流式细胞术分析测试变应原存在下的嗜碱性粒细胞活化

取含有染色混合物的流式管，该混合物包含悬浮于刺激缓冲液中的荧光标记单克隆抗体。

将测试变应原的不同递减浓度加入多个试管中。向其中一个试管加入抗 IgE 抗体作为 IgE 介导的阳性对照，向另一试管中加入缓冲液作为阴性对照。

用移液器将人外周血加入试管中。孵育。

如果个体对测试变应原致敏，则此次暴露会导致变应原与结合在嗜碱性粒细胞表面 Fc 受体上的特异性 IgE 抗体结合。

变应原通过交联IgE结合的Fc受体，导致嗜碱性粒细胞活化。

嗜碱性粒细胞发生脱颗粒，释放含有炎性介质的胞内颗粒，同时CD63和CD203c分子表达上调。

荧光标记的单克隆抗体分别与嗜碱性粒细胞上的 CD63、CD203c 和 CCR3 结合。

降低温度以停止嗜碱性粒细胞脱颗粒。

加入缓冲液以裂解红细胞并固定细胞。

使用流式细胞仪，从淋巴细胞群体中鉴定出嗜碱性粒细胞。

以 CD63 作为活化标志物，分析在递减的过敏原浓度下嗜碱性粒细胞的活化情况。

首先采集外周血至 9 毫升含肝素的试管中，并将样本置于转子中，于室温下保存，直至实验方案需要时使用。

标记两个5毫升流式管，分别用于阴性对照和阳性对照。同时，为待测的不同过敏原或药物浓度各标记一个试管。然后，将试管放入试管架中，确保试管完全贴合，不会滑动。

对于第一个阳性对照，用含0.05% PBST的溶液配制4 µM的N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）溶液，以确认嗜碱性粒细胞的质量。对于第二个阳性对照，使用PBST配制0.05 mg/mL的抗IgE溶液。通过在每20 µL刺激缓冲液中加入CCR3-APC、CD203c-PE和CD63-FITC抗体各1 µL，来制备染色混合液。然后，向每管中加入23 µL该染色混合液。

向阴性对照管中加入 100 微升 PBST，向其中一个阳性对照管中加入 100 微升 fMLP，向另一个阳性对照管中加入 100 微升抗 IgE。向其余各管中分别加入 100 微升不同浓度的过敏原或药物溶液，并在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。孵育结束后，轻柔地向每根试管中加入 100 微升血液，以避免溶血。然后轻轻涡旋混匀各管，并在恒温浴中以中等振荡强度于 37 摄氏度孵育 25 分钟。

将试管置于 4 摄氏度下至少 5 分钟，以终止脱颗粒反应。向每支试管中加入 2 毫升裂解缓冲液，以裂解红细胞。涡旋混匀每支试管，然后在室温下孵育 5 分钟。在 4 摄氏度下以 300 × g 离心 5 分钟。随后将试管架倒置在水槽上方，倾倒上清液，同时使细胞沉淀保留在试管底部。向每支试管中加入 3 毫升 PBST 以洗涤细胞，并涡旋混匀。使用相同的参数进行第二次离心，再次通过将试管架倒置于水槽上方倾倒上清液。然后将样品置于 4 摄氏度下避光保存，直至进行流式细胞术分析。

将流式细胞仪连接至计算机软件，并等待细胞仪准备就绪。按照文本稿件中的描述加载模板和仪器设置。开始样品采集过程。

为了筛选活化的嗜碱性粒细胞，首先从侧向散射-前向散射图中获取淋巴细胞。然后从淋巴细胞群体中选取CCR3阳性且CD203c阳性的细胞作为嗜碱性粒细胞，并每管至少获取500个嗜碱性粒细胞。使用阴性对照管将CD63阴性阈值设定为约2.5%，然后分析样本。