使用同一种宿主来源的一抗进行多重免疫染色的方法

取包含皮质和髓质的固定且通透的肾上腺切片。用煮沸的酸性缓冲液处理，以破坏固定所引起的交联，从而实现抗原暴露。

封闭非特异性结合位点，并加入可结合皮质特异性标记物的一抗。

加入针对一抗的生物素标记的二抗，以及与生物素结合的链霉亲和素偶联过氧化物酶。

加入荧光素标记的酪胺和过氧化氢。

固定的过氧化物酶利用过氧化氢激活酪胺，后者与邻近蛋白质结合，从而标记细胞皮层。

接下来，用煮沸的缓冲液处理切片，以去除结合的抗体。

加入由相同宿主物种产生的针对髓质特异性标志物的一抗以及生物素标记的二抗。

加入链霉亲和素偶联的过氧化物酶和另一种荧光素偶联的酪胺，以标记髓质。

去除皮层特异性的一抗可抑制重新加入的二抗与之结合，从而防止交叉反应。

使用核染色剂进行染色并成像，以清晰显示皮质和髓质，确认无抗体交叉反应性。

染色前，按照所示顺序，将福尔马林固定、石蜡包埋的切片分别浸入各溶液中，每种溶液浸泡5分钟，进行脱蜡和水化。第二次蒸馏水浸泡后，将切片置于带盖的移液器吸头盒底部的275毫升煮沸的柠檬酸钠溶液中，然后将盒子放入700瓦微波炉中，以70%功率加热8分钟。

处理结束后，打开盖子，待溶液冷却至室温后，再在 Coplin 染色缸中用新鲜的 PBST 溶液洗涤载玻片，每次五分钟，共洗涤三次。为阻断任何非特异性结合位点，在最后一次洗涤后，轻轻震荡去除载玻片上多余的 PBST，并加入足量的适当封闭液覆盖载玻片。

在湿润的孵育盒中室温孵育30分钟后，轻轻震荡去除每张切片上多余的封闭液，并向每个样本中加入250微升目标的第一种一抗。为防止样本干燥，可用一层石蜡膜覆盖切片。

在湿盒中于4°C过夜孵育后，用新鲜的PBST洗涤载玻片三次，每次洗涤5分钟。甩去多余的PBST，然后迅速在每张载玻片上加入250 µL适当的二抗溶液，在湿盒中室温孵育1小时。

孵育结束后，如所示用新鲜的PBST洗涤载玻片三次，然后向每张载玻片上加入250 µL新配制的链霉亲和素-辣根过氧化物酶溶液。室温孵育30分钟后，用新鲜的PBST洗涤载玻片三次，甩去多余的PBST，再向每张载玻片上覆盖250 µL新配制的荧光素酪胺溶液。

一分钟后，将切片浸入新鲜的PBST中，随后用新鲜的PBST洗涤三次，每次两分钟。最后一次洗涤后，在切片上滴加数滴体积比为1:1的甘油与PBS混合溶液，通过荧光显微镜观察荧光信号的存在情况。

为去除第一抗体复合物，将带有抗体标记的载玻片放入275毫升沸腾的柠檬酸钠溶液中，至少处理八分钟，操作如图所示。处理结束后，打开盖子，让溶液冷却至室温，然后用PBST洗涤载玻片三次，每次五分钟。

为了染色第二个目标蛋白，在证明已阻断非特异性结合后，将各样本与250微升目标第二抗体在4摄氏度下孵育过夜。次日早晨，用新鲜的PBST对切片进行三次洗涤，每次五分钟，随后每张切片加入250微升合适的二抗溶液，在室温下孵育一小时。

孵育结束后，如图所示，用新鲜的PBST将玻片洗涤三次，然后向每张玻片加入250 µL新配制的链霉亲和素-辣根过氧化物酶。在三次PBST洗涤后，为显影第二个目标蛋白的信号，用另一种荧光光谱的荧光素偶联酪胺对玻片进行处理。

为了终止酪酰胺信号的显色反应，将切片浸入PBST中，然后用适当的细胞核染料对样本进行染色。