纯化与分析 秀丽隐杆线虫 细胞外囊泡

细胞外囊泡领域一直缺乏可用于研究细胞外囊泡蛋白质和RNA信号的遗传学可操作的无脊椎动物模型。本实验方案建立了从秀丽隐杆线虫（C.elegans）中获取大量且高纯度细胞外囊泡的方法，所得样品足以进行可靠的RNA测序（RNA-SEQ）和蛋白质组学分析。

当同步培养的秀丽隐杆线虫（C.elegans）耗尽其正常生长培养基平板上的食物后，使用橡皮筋将一个孔径为五微米的尼龙网滤器固定在无菌瓶口，并启动真空泵。将L1期线虫倒入滤器中，并用与样品等体积的培养基冲洗线虫聚集体。涡旋振荡后，取三份各10微升的线虫悬液，分别转移至线虫培养板的盖子上，计数每滴中的线虫数量。

将线虫悬液调整至每微升新鲜培养基中含有两条线虫，并再次涡旋混匀悬液。接着，将九个10微升的线虫液滴加到新培养皿的盖子上，人工计数每滴中的线虫数量。然后计算每个线虫群体中动物数量的平均值及平均值的标准误差（以百分比表示），并计算每个群体中的线虫总数。

为准备用于分泌组生成的线虫，用15毫升无菌M9培养基对平板上的线虫进行三次洗涤，每次五分钟，每次加入50微克/毫升羧苄青霉素，轻轻旋转以使线虫脱离，将各次洗涤液收集至一个50毫升锥形管中。最后一次洗涤后，将线虫稀释至每微升S-巴塞尔溶液中含一个线虫，该溶液需添加2.5微克/毫升胆固醇和50微摩尔浓度的羧苄青霉素。然后，最多加入400毫升线虫悬液至一个无菌的两升底部带挡板的烧瓶中。

将烧瓶置于20摄氏度、100转/分钟的旋转摇床上孵育24小时。为收获细胞外囊泡，将线虫转移至50毫升锥形管中进行离心，并通过0.22微米真空滤膜倾倒上清液，以去除任何颗粒碎片。计数后，取一滴悬浮线虫置于细菌菌苔上，15分钟后观察动物状态，记录为活动、麻痹或死亡。

接下来，使用再生型硝酸纤维素10千道尔顿截留分子量滤膜将过滤后的上清液浓缩至700微升，并向还原液中加入150微升新鲜的S-Basel溶液。过滤并涡旋振荡所得溶液，重复还原和过滤步骤两次，操作方法同上。最后一次过滤后，离心上清液以去除在操作过程中可能积聚的任何颗粒和碎片，并根据制造商说明书添加蛋白酶抑制剂混合物及EDTA。

为准备尺寸排阻层析柱，将15毫升悬浮的琼脂糖树脂倒入一个空的重力流层析柱套件中。待柱体排干后，加入S-Basel溶液，使树脂床最终体积压紧至10毫升。用40毫升无菌过滤的S-Basel溶液替换树脂中的缓冲液，注意不要扰动树脂，并让缓冲液依靠重力自然流过层析柱。

当树脂顶部不再浸没时，封闭柱子底部以停止液体流动，并在柱子下方放置一个收集管。为启动分泌组分的分离，取下封帽，立即将浓缩的分泌组溶液逐滴加至柱床顶部，随后逐滴加入一毫升 S-Basel 溶液。在柱子下方放置一个新的收集管，并缓慢向柱子上部储液区加入五毫升 S-Basel 溶液。

收集前2毫升洗脱液后，迅速更换离心管以收集接下来的4毫升洗脱液。使用再生的硝酸纤维素10千道尔顿分子量截断离心过滤器，将含有细胞外囊泡的柱洗脱液浓缩至300微升，并将滤膜截留物转移至低吸附性微量离心管中。随后，每次用100微升S-Basel溶液洗涤滤膜两次，每次涡旋20秒，将洗涤液与原始截留物合并，最终样品体积为500微升。

为了通过流式细胞术分析对外泌体进行定量，向一个微量离心管中加入840 µL S-Basel溶液和60 µL纯化的外泌体。将300 µL样品分别加入另外两个微量离心管中，每管再加入7 µL适当的电位探针。向最后一管中加入7 µL 1% Triton X-100，并用涡旋振荡器混匀所有离心管。

将超声波破碎仪探头置于第三个样品管的中心位置，以20%的功率和30%的占空比对样品脉冲处理10次。接着，向两个对照微量离心管中各加入300微升S-Basel溶液，并向仅含染料的管中加入7微升探针。将第二个管标记为Buffer Only。

然后将所有试管在室温下避光孵育一小时，再根据标准方案进行流式细胞术分析。分析数据时，在相应的流式细胞术分析软件中打开文件。在图谱顶部设置一个矩形门，横跨从小角度光散射水平的1×10至2×10⁴的范围，并将门向下延伸，直至其包含约2.5%的总事件数。

根据探针的名称命名门控，并将该门控复制粘贴到另外两个样本和对照数据图上。然后将分析结果导出至电子表格。此处展示的是来自10个生物学重复的代表性结果。

重复样本之间的变异性不显著，种群数量均值的典型标准误差略高于10%。将线虫在培养板之间转移会导致约10%的个体损失，而在蔗糖漂浮步骤中约有20%的个体损失。平均而言，1,000条野生型年轻成虫会向环境中分泌超过1微克分子量大于10千道尔顿的蛋白质。当该组分通过尺寸排阻色谱进一步分离时，总蛋白洗脱谱图显示在2至6毫升之间出现一个小的蛋白峰，以及在8毫升之后出现一个较大的主峰。

细胞外囊泡存在于层析柱洗脱液的前五毫升中。在秀丽隐杆线虫（C.elegans）与人类细胞外囊泡的流式细胞术特征直接比较中，按前向角光散射排序的秀丽隐杆线虫细胞外囊泡样本事件直方图显示，所有制备样品的峰值均位于平均荧光强度约为1×10³处。电位敏感探针DI-8-ANEPPS可有效标记秀丽隐杆线虫细胞外囊泡，且根据DI-8-ANEPPS表达水平分选得到的纯化细胞外囊泡丰度在秀丽隐杆线虫与细胞培养来源的制备样品之间无显著差异。

通过本方案制备的样本适用于所有常规的下游细胞外囊泡分析方法，包括RNA测序（RNA-SEQ）、流式细胞术、纳米颗粒追踪分析以及蛋白质组学分析。建立秀丽隐杆线虫（C.elegans）细胞外囊泡的纯化方法，可使研究人员利用这一简单的无脊椎动物模型，研究影响细胞外囊泡内容物组成的遗传通路和生理过程。