利用菜豆（Phaseolus vulgaris）作为示例的植物叶片质外体液渗透-离心提取技术

本实验的目的是演示利用渗透离心法从植物叶片中提取无细胞液的过程。首先将叶片浸入渗透液中，利用注射器或真空泵产生的压力差，使渗透液充分进入叶片组织。第二步是使用支撑装置对叶片进行处理，以备离心。

接下来，轻轻离心叶片以获得 APO 塑体洗涤液。最后一步是确定 APO 塑体的稀释倍数，并检测最后一次洗涤液的质量。最终，通过浸润离心法获取具有代表性的 APO 塑体样品，可用于多种下游分析。

该技术相较于其他现有方法的主要优势在于，它易于针对多种叶片类型进行优化，从而获得细胞质化合物污染最少的上表皮加表皮下层组织样品。该方法有助于回答植物生理学和植物-微生物互作等领域中的关键问题，因为在这些领域中，了解不同植物之间以及不同生理条件或胁迫下表皮液泡（APLs）成分的变化至关重要。第一步，应采取安全预防措施，穿戴实验服、手套和护目镜。

接下来，准备一定体积的蒸馏水用于浸没叶片样品。准备好剃刀刀片，以便采集样品，在本例中为菜豆栽培品种“嫩绿”的叶片。将剃刀刀片紧贴叶片边缘，并从植株上切下叶片。

采集后，将新鲜切除的叶片浸入蒸馏水中，以去除叶面污染物。然后用吸水纸轻轻吸干叶片。在进行渗透处理前，测量叶片重量。

这将有助于后续估算渗透体积。使用60毫升注射器开始渗透过程。取下注射器的活塞后，小心地将叶片卷起或折叠放入注射器中。

接下来，用浸润液填充注射器。此处使用的是蒸馏水。插入活塞并将注射器倒置，以排出其中的任何空气。

记录叶片颜色，以便后续比较。使用一小块封口膜将活塞推至40毫升刻度处。盖住注射器尖端。

然后将活塞拉至60毫升刻度处，以产生负压。将注射器倒置，使叶片表面的气泡释放。在约两秒内缓慢将活塞恢复至起始位置。

取下注射器针头的保护帽，排出其中的空气。然后再次盖上针头帽，推动推杆以产生适度的正压。持续交替施加负压以排出空气和施加正压，直至叶片完全浸润。

完全浸润的证据是浸润区域颜色变深。一旦观察到此现象，将叶片从注射器中取出。用吸水纸轻轻按压叶片以去除表面液体。

然后测量浸润后叶片的重量，另一种浸润方法可使用真空抽滤瓶。再次采集一片叶片，并用蒸馏水冲洗。吹干后，测量叶片重量。

取一个最小容量为250毫升的侧臂烧瓶。将叶片放入烧瓶中，并用蒸馏水完全浸没。接着，用塞子密封烧瓶，并将真空泵连接至侧臂。

对烧瓶抽真空，持续足够长时间以达到约650毫米汞柱的压力。在减压条件下，轻轻摇动烧瓶，使叶片中的气泡释放出来。

然后在约10秒的时间内缓慢而小心地释放真空。重复进行抽真空、振荡烧瓶和释放真空的操作，直至叶片完全浸润。完全浸润的标志是浸润区域颜色变深。

从烧瓶中取出完全浸润的叶片，用吸水纸轻轻吸干叶片表面。为去除表面液体，称量浸润后叶片的重量，以确定大致的浸润体积。叶片完全浸润后，将其准备好进行离心。

铺开一片宽度为四英寸的石蜡膜。将叶片放置在石蜡膜上。然后使用5毫升移液器吸头，将叶片连同石蜡膜一起卷起。

取一个20毫升的注射器筒，移除活塞，用移液器吸头将卷好的叶片插入注射器中。将叶片任何切割的边缘朝向活塞端。取一个50毫升的聚乙烯或聚碳酸酯管，将注射器插入其中。

使用配备水平转子的离心机。将含有浸润叶片的离心管放入离心机中，在4°C、1000 ×g条件下离心10分钟。离心结束后，检查叶片以确定大部分浸润液是否已被甩出。

离心管中现在含有回收的 APO 塑料洗涤液，继续用移液器将回收的塑料洗涤液转移至新的 1.5 毫升离心管中。将 APO 塑料洗涤液样品放入离心机，以 15,000 G 离心 5 分钟，以去除任何细胞或颗粒物质。离心后，用移液器将上清液转移至新的离心管中。

将样品置于冰上，直至可储存于负80摄氏度。评估APO平板洗涤液质量的一种方法是计算APO平板稀释因子。为此，准备两份渗滤液（本例中为蒸馏水），每份体积足以进行多次渗滤，与一份体积混合。

加入靛蓝胭脂红粉末至终浓度为 50 微摩尔。另一组不添加任何物质。取一个 96 孔微孔板，向其中三个孔各加入 200 微升的渗透溶液。

使用靛胭脂，将另外三个微孔板孔各加入200微升未添加物质的渗透溶液基质，将微孔板放入读板仪中测定每种液体的吸光度。在610纳米处，含靛胭脂液体的平均吸光度减去不含靛胭脂液体的平均吸光度，得到渗透液的校正吸光度。接下来，对每种渗透溶液重复叶片渗透实验方案三次。

将叶片样品浸入水中。使用靛蓝胭脂红浸润液时施加负压和正压，浸润后用蒸馏水冲洗叶片，以去除叶表面残留的靛蓝胭脂红。通过离心回收最后一次洗涤液。

回收最后一次洗涤液后，将其放回微孔板的孔中。向各孔中加入200 µL不含靛蓝胭脂红的提取液，以及200 µL含靛蓝胭脂红的最后一次洗涤液提取液。在610 nm处测定样品的吸光度，以获得校正后的吸光度。

对每组数据取平均值并计算差值。利用渗出液的校正吸光度和无细胞洗液的校正吸光度，确定APL稀释因子，以估算无细胞液中的浓度或活性。随后，将最后一次洗涤液的浓度或活性值乘以从芸豆品种（fasi vulgaris cultivar）中获得的该稀释因子。

嫩绿色用于生成该气相色谱-质谱有机酸图谱。单糖和氨基酸构成了可识别代谢物的主体。以下是 fasii vulgarus 经多次洗涤后叶片提取物的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱与考马斯亮蓝染色凝胶的比较。

不同提取方法的胞质污染程度存在差异，这表现为不同量的固着酶rubis。进行此操作时，重要的是要牢记，务必尽可能轻柔操作，至少应避免造成任何组织损伤或胞质污染。

还可以进行其他方法，如蛋白质或代谢物质谱分析，以回答有关无菌液体成分的其他问题。无菌冲洗液也可用作粗略培养基，用于研究无菌化学物质对定植于植物组织中的微生物的影响。