搭建简易光片显微镜用于 整体 成像 秀丽隐杆线虫 发育

本实验的总体目标是利用荧光光片显微镜对 C Allergan 的发育过程进行成像。首先，需搭建基于光片的显微镜系统，该系统由一台正置显微镜和一组小型光机械元件组成，用于生成光片。实验的第二步是将胚胎进行固定和装载。

最后的步骤是调整光片对准胚胎并记录其发育过程。结果可通过分析三维和延时视频，展示秀丽隐杆线虫发育过程中荧光标记蛋白的动态变化。与共聚焦显微镜等现有方法相比，光片显微镜的主要优势在于能够实现更快的成像速度，同时光毒性更低。

第三，该方法有助于深入了解封育过程中的变化。该方法还可应用于其他体系，如油菜或斑马鱼。演示该操作流程将更加清晰明了。

Shales 是我实验室的工程师，Pauline Linac 是 van 实验室的工程师。本节介绍装置的组装过程，组装完成后可保持不变，用于所有实验。将激光器、滤光片、望远镜和潜望镜全部放置在光学平台上并定位后，固定圆柱透镜以生成光片。

调节另一个透镜以对焦。照明物镜的焦点应与检测物镜的物方焦点重合。现在，将光束投射到墙壁或屏幕上，并沿光束轴线移动照明物镜，直至投影的轮廓变得清晰。

在显微镜设置中包含四线发射滤光片和E-M-C-C-D相机。将第二个手动平移台以垂直方式固定到第一个平移台上。将组件拧紧至现有的显微镜载物台上。

取下设定的柱面透镜照明物镜后，将组件安装到显微镜上，并将照明装置重新放回载物台上。将 qve 持镜架固定在照明光路与检测光路的垂直交汇处。现在，检查光片情况。

将荧光素溶液注入玻璃小瓶中，并将其放置在载物台的支架上。光片应清晰可见，且相对于检测物镜应保持水平并居中。

接下来，移除柱面透镜。通过对照明物镜进行三维平移来优化光片，并采集图像以测量光片的厚度。该厚度取决于物镜的孔径。

然后务必更换圆柱透镜。首先，用金刚石标记笔切割一块厚度为1毫米、尺寸为10毫米×20毫米的玻璃。

接下来，向一侧加入 20 微升多聚赖氨酸（poly L lysine），待其干燥后，将其与第二张载玻片并置。固定位置后，在上方加入一滴 5% 琼脂，并用第三张载玻片压在上面使其表面平整。待琼脂干燥后，取下第三张载玻片，并从剩余两张载玻片边缘向未加多聚赖氨酸的载玻片一侧，距边缘三毫米处切割琼脂垫。

然后移除固定的载玻片，留下突出的琼脂部分。用20微升多聚-L-赖氨酸覆盖琼脂表面，并使其自然干燥。现在将GR线虫放入盛有M9培养基的表面皿中，并置于解剖显微镜下。

用解剖刀在与阴门齐平的位置切割线虫，从而释放出卵。随后鉴定处于目标发育阶段的胚胎，并用微毛细移液管收集这些胚胎。将胚胎转移至预制载玻片边缘外侧的琼脂悬臂上，位置应紧邻载玻片边缘，但不要放在琼脂的边界处。

然后用微毛细移液管在去除液体的同时对胚胎进行排列。通过抽吸，胚胎会粘附在聚赖氨酸上。正确地定位胚胎对于获得良好的记录至关重要，这需要使用合适口径的毛细管。

如果孔太小，将难以释放胚胎；如果孔太大，则难以精确控制泄漏的流量并使胚胎排列整齐。用培养皿中的M9培养基覆盖载玻片，并在放大条件下确认胚胎仍然附着在琼脂上。现在，将带有胚胎的制备好的载玻片固定到适用于vete的样品架上。

该固定装置为实验室自制的装置，设计用于适配显微操作仪。接下来，将显微操作仪固定在压电陶瓷平台上，在明场照明下定位胚胎。然后启动控制声光可调滤波器的软件程序。

过滤相机和载物台。此处使用的软件为自主研发，但也可使用 Micromanager 免费软件。首先，选择激光线。

接下来，沿 x 轴调节载物台，直至光片亮度达到最高。然后调节另外两个维度 Y 和 Z，直至信噪比达到最佳。每个胚胎可能都需要重复此步骤。

该关键步骤旨在通过调节自由移动的载物台、支撑物以及消除物镜之间的相互关系，以获得胚胎的连续模拟图像并达到最佳对比度，从而优化信噪比，实现良好的成像记录。现在开始采集延时图像，根据胚胎的荧光强度以及所分析生物学过程的速率，设置激光功率、曝光时间、增益和成像时间间隔。针对Zack。

利用表达组蛋白GFP构建体的秀丽隐杆线虫（C. elegans）进行成像，设定切片间距及其起始与终止位置。每37秒采集20组切片图像，进行持续2小时的时间序列成像。在表达微管蛋白与GFP融合蛋白以及组蛋白与mCherry融合蛋白的品系中，细胞分裂过程清晰可见。每105秒进行一次记录，每次持续16分钟。

在三个时间点展示了三维渲染图像。有丝分裂纺锤体和凝缩的染色体清晰可见，并可轻松追踪细胞分裂过程。在第三种菌株中，APO脂蛋白Vit2与GFP融合，并用mCherry标记细胞膜进行成像。

在13分钟内，每隔27秒采集一组切片图像，共采集10组。快速移动的脂蛋白颗粒易于追踪。此处我们采用更为复杂的方法生成的光片进行成像。

光片可用于进一步提高空间分辨率。