通过闪速纳米沉淀法快速、可放大的生物活性蛋白和免疫刺激剂组装与装载至多种合成纳米载体

我们认为，利用闪速纳米沉淀法组装复杂纳米结构，将使那些在化学、工程学或纳米材料科学领域经验有限的研究人员能够独立制备适用于自身特定应用和需求的先进药物递送系统。该技术的主要优势在于可在无菌条件下大量生成种类多样的纳米结构，具有高浓度、低多分散性，并可负载包括小分子药物和蛋白质在内的多种生物活性分子。通常，初涉聚合物合成的研究人员可能会遇到困难，因为聚丙硫醚组分对空气暴露引起的氧化反应极为敏感。

该方法的可视化演示至关重要，因为多步撞击操作难以掌握，需要连续快速地完成。为对封闭撞击射流装置（即CIJ混合器）进行灭菌，请在生物安全柜内将拆解后的各部件完全浸入0.1 M氢氧化钠溶液中过夜。随后重新组装CIJ混合器，使用鲁尔锁紧式注射器将无内毒素水通过混合器，并检测水流的pH值，持续通水直至pH值显示为中性。

配制撞击溶液一：首先，将20毫克合成的聚合物称量至1.5毫升离心管中。然后加入疏水性染料、药物或其他货物。最后，向聚合物和货物中加入500微升100%四氢呋喃，剧烈涡旋以充分溶解。

为了配制撞击溶液二，将要装载到聚合物囊泡内的亲水性货物溶解于500微升的水相缓冲液中。向适当大小的储液器中加入2.5毫升所选的水相缓冲液。然后，将储液器置于CIJ混合器下方，使混合器的流出液直接进入储液器。

将撞击溶液分别装入1毫升塑料一次性注射器中，然后将注射器插入CIJ混合器顶部的鲁尔锁接头，使溶液相互撞击，从而同时形成纳米结构。以单一、平稳且快速的动作，同时以相等的力度压下两个注射器。如果需要进行多次撞击，必须尽可能快速地完成，以减少挥发性有机溶剂的损失。

为进行多次撞击，将新生的纳米结构溶液分装至两个注射器中，并重复此步骤最多四次。将流出液收集到装有水相缓冲液的储液池中，并轻轻搅拌以确保充分混合。有多种方法可用于去除未负载的货物和有机溶剂。

可通过切除排除或脱盐柱、切向流过滤系统、真空干燥或透析去除纳米载体制剂，此处以透析为例进行说明。使用与冲击过程相同的水相缓冲液和储液器对纳米载体制剂进行透析。选择适当分子量截留值的透析管，透析时间至少为24小时，并至少更换两次缓冲液。

将未载药的货物从有机溶剂中移除后，按照制造商的说明，使用离心浓缩系统对纳米载体制剂进行浓缩。纳米载体可在4摄氏度下保存数周至数月。储存后使用前，应将纳米载体制剂短暂涡旋混匀。

按照文本方案中的描述进行高速注射泵的制作。要使用自动运行模式，请从主菜单中选择自动运行。系统将提示用户允许电机自动将注射器推注平台定位到精密滑轨的起始位置。

操作前请确保金属板前后路径畅通。将CIJ混合器装入后部排出滑块的矩形开口中。然后，像之前一样装入1毫升塑料注射器，并将注射器安装到CIJ混合器的雌性接头连接口上。

在运行仪器之前，按照文本方案中所述设置所需的电机转速，并检查系统是否畅通。在软件界面中按下运行按钮，将反应物从注射器推出并注入CIJ混合器中。具有代表性的低温透射电子显微图像显示，经过多次撞击后形成的聚合物囊泡更小且分散性更均一。

动态光散射分析证实，经过多次撞击后，聚合物囊泡的粒径分布向左偏移。经过五次重复撞击后，聚合物囊泡的平均直径和多分散性与通过薄膜水合法制备的挤出样品相当。快速纳米沉淀法可用于将多种疏水性和亲水性小分子及大分子装载到聚合物囊泡中。

尽管该方法可为免疫疗法和疫苗的作用机制提供见解，但也适用于研究聚合物如何自组装成复杂的纳米结构。在完成该实验步骤后，可进一步对动物模型进行静脉注射或皮下注射等其他方法，以确定哪些细胞亚群摄取了这些纳米颗粒，或不同纳米结构的清除途径是什么。该技术的应用前景涵盖心脏病和癌症的治疗，以及传染病疫苗的开发，因为这些纳米载体能够将多种药物靶向递送至特定的免疫细胞。