利用适用于Gateway系统的双分子荧光互补（BiFC）技术检测植物中的蛋白质相互作用

为了检测两种蛋白质之间的相互作用，需要使用Gateway长片段克隆技术将两个目的基因分别克隆到我们的BF和载体中。将构建好的质粒转化至农杆菌GV3101中。含有相应构建质粒的GV3101菌液将被混合，并共同浸润到叶片中。

如果两个候选蛋白相互作用，则可以利用结果聚焦墨西哥观察到YFP信号。双分子荧光互补（BFC）技术的主要目的是检测两种蛋白之间的相互作用。在vavo中，我们构建了一系列与gateway兼容的BFC和IS双杂交载体，为研究人员提供了易于使用的工具，以开展BFC和ISTO双杂交实验。

在本视频中，我们将展示使用我们的BFC系统的便捷性。为了以不受表达系统限制的方式检测蛋白质及其相互作用，首先需要制备GV3101菌株的细菌培养物。

需要从平板上挑取单个菌落，接种到含有适当抗生素的5 mL YEB培养基中。然后在28°C、200转/分钟的条件下振荡培养过夜。

细菌培养物应在第二天早上准备好。确保细菌已过夜培养。从培养箱中取出培养物，将每种培养物中的一个1.5 mL离心管转移至无菌的1.5 mL离心管中。

将离心管放入台式离心机中。在室温下以1000 ×g离心10分钟，沉淀细菌，弃去上清液。然后通过加入1毫升浸润培养基并轻轻吹打数次重悬菌体沉淀。

重复洗涤步骤再进行两次。此步骤非常重要，因为它有助于去除细菌培养基中残留的抗生素，这些抗生素会在浸润后对植物造成伤害。最后一次洗涤后，用0.5 mL的浸润培养基重悬菌体沉淀，并以浸润培养基作为空白对照，在分光光度计中测定该菌液悬浮液的OD600值。

在测定OD后，你需要使用侵染介质调整OD值，最终OD值应介于1至1.2之间。在进行下一步操作前，应准备好所有细菌悬浮液。

取等量的两种候选蛋白对应的细菌悬液，转移至一个新的1.5 mL离心管中，混合均匀，得到用于侵染的阴性细菌混合物。请准备所有需要的组合，并务必设置阴性对照。侵染时应使用五到六株健康且生长状态良好的植物。

可将植物从培养室中取出，在侵染前将其置于弱光下放置一小时，以打开气孔。这将有助于侵染过程。吸取约100 µL重悬的Resus细菌溶液。

取一支接近一毫升的无针头移液枪，将枪头抵住叶片的下表面。用手指支撑叶片的上表面。

通常情况下，按压活塞。你应该能够看到液体扩散到叶片中，此时中脉感觉更薄。在渗透后，使用记号笔在叶片上标记已渗透区域，否则两天后你将无法辨认出已渗透的区域A。如果你需要用不同的细菌混合液进行渗透，请确保在每次渗透之间用50%乙醇喷洒手套，或更换手套。

尽量在每次浸润之间留出1米的肋间距离，以防止交叉污染。从浸润开始起，应每24小时监测一次PFA信号，持续五天。可使用两个不同尺寸的保护套管来固定样品。

首先，在凹槽盖片上滴加一滴微型水。然后在浸润区域内裁剪一小块刀片纸巾。尽量避免损伤样本中的恶心静脉。

将切割好的刀片组织置于载玻片上的水中，放好后用较小的套管覆盖，并轻轻按压。现在即可在显微镜下观察样品。此处我们使用 NACA T CSS P 两光子共聚焦显微镜来观察 BIFC 信号。

即使是常规的香精墨西哥也可使用。共聚焦显微镜可提供更清晰的图像并检测弱信号。您可以使用YFP参数在此NCAs P二系统中检测VFC信号。

您可以直接双击此处的YFP预设，系统将自动开启激发光并设置发射光检测范围。如果您使用的是其他系统，请参考说明书以正确设置参数。我们希望在观看本视频后，您能够掌握如何利用unbe MI Transcend表达系统进行BFCE实验，以检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用。

您也可以将该程序应用于烟草和 AY 植物。我们的 BFC 载体分别包含 HA 标签和 Flag 标签，因此如有必要，您还可以进行免疫共沉淀（co-IP）以验证相互作用。