双分子荧光互补

本实验旨在确定两种蛋白质在细胞内是否发生相互作用，并阐明相互作用位点的相关特征。首先，将表达载体转染至细胞中，这些载体分别编码两种目标蛋白质，其中一种蛋白质与断裂的荧光蛋白的N末端片段融合，另一种蛋白质则与断裂的荧光蛋白的互补C末端片段融合。在转染后的细胞于培养过程中产生荧光信号后，通过成像和免疫印迹技术对形成的蛋白质复合物进行可视化检测。

接下来，将采集的图像导出至图像分析软件（如 Image J），以量化每个细胞的平均荧光强度。在受控实验中，BIFC 结果可展示蛋白质-蛋白质相互作用以及这些复合物的定位情况，例如支架蛋白中的 SH3 结构域与 PI3KC2β 中的富含脯氨酸结构域之间的相互作用。与现有的共定位、免疫共沉淀和 FRET 等方法相比，该技术的主要优势在于，BIFC 能够实现细胞内较弱且瞬时相互作用的空间定位，并且该方法无需像 FRET 那样进行复杂的图像后期处理。

该方法可解决信号转导领域中的关键问题，例如蛋白质X与Y是否相互作用，如果存在相互作用，这些复合物在细胞内的具体定位区域是什么？通常，初学者在使用该方法时会遇到困难，因为他们未选择合适的表达活检样本的配置。首先为感兴趣的靶蛋白选择BIFC融合蛋白所用的多种荧光染料中的一种。

需要注意的是，Venus 蛋白的氨基端和羧基端能够在 37 摄氏度下形成复合物，而 Y-F-P-B-I-F-C 片段则需要在 30 摄氏度下预先孵育。在设计用于为目标蛋白添加标签的表达载体时，应考虑 BIFC 片段的连接是否会影响目标蛋白的功能。例如，Ras 家族的 GTP 酶在羧基末端会发生脂质修饰，若在此末端添加标签会破坏该修饰过程，因此不能在这一端进行标记。

始终进行预实验以确定转染条件。同时通过荧光显微镜观察细胞，以确定信号表达的最佳时间。然后进行蛋白质印迹分析，以确认各构建体的表达水平相等。

重要的是，对每个样品板进行HA或Flag标签的免疫染色，以验证BIFC片段的添加不会改变目的蛋白的细胞定位。将1.3×10⁵个细胞分别接种到一个玻璃底培养板以及六孔板的两个孔中，并在37°C培养箱中静置过夜；次日，通过脂质体转染或其他偏好的方法制备用于转染的DNA。

首先，将 DNA 溶于 250 µL 无血清 DMEM 中，作为转染对照。加入 CFP，其量为总 BIFC DNA 量的五十分之一。然后，每 1 µg DNA 使用 10 µL 脂质体，将脂质体溶于 250 µL 无血清 DMEM 中。

将DNA与脂质稀释液混合，在室温下孵育20分钟。用预热的无血清DMEM洗涤细胞两次。向每个玻底培养皿或六孔板的每个孔中加入2毫升无血清DMEM。

然后将每份转染混合物均匀分配至一个玻璃底培养皿和六孔板中的两个孔，于37摄氏度培养细胞5小时。最后，移除转染培养基，更换为含10% FBS的完全DMEM培养基。

根据预实验确定的时间孵育细胞，以获得目标蛋白所需的表达水平。在落射荧光显微镜下观察转染后的细胞，确保阳性对照具有荧光信号。进行活细胞成像前，用PBS洗涤细胞三次。

将细胞置于不含指示剂染料的培养基中。用于成像固定细胞时，加入2%多聚甲醛，冰上放置10分钟。

然后用 PBS 清洗细胞三次，每次加入一毫升 PBS，清洗后将细胞置于四摄氏度避光保存，并立即在六孔板中裂解细胞。进行 Western 印迹分析时，所有细胞必须同时制备，以确保裂解细胞能代表成像细胞的状态。通过 Western 印迹检测，确认标签蛋白的表达水平相当。

使用共聚焦显微镜对细胞成像时，需在整个实验过程中保持设置恒定，以确保不同样本间的荧光信号具有可比性。务必对单个细胞进行成像，确保像素未达到饱和。由于实验中使用CFP作为转染对照，因此仅选择CFP阳性细胞进行BIFC信号分析。

使用成像软件（如 ImageJ）对荧光进行定量。在 ImageJ 中打开图像文件。进入“分析”菜单，选择“设置测量”。在测量选项框中，勾选“面积”和“平均灰度值”。请注意，在本示例中，静脉图像被伪染为绿色，而 CFP 图像被伪染为红色。

使用自由选择工具，在CFP通道中围绕整个细胞的边缘绘制轮廓，并保持该轮廓位置不变。切换到YFP通道，进入分析菜单，测量平均灰度值，该值反映每张图像中每个细胞的平均荧光强度。

在不含细胞的区域，于YFP通道中画一个圆。对该区域进行测量，作为背景值。从每张图像中减去该背景值。

最后，为了计算一组细胞的平均荧光强度，需对一个样本中所有成像细胞的平均灰度值减去背景值后取平均。理想情况下，应在三次实验中定量分析共计60个细胞。多结构域支架蛋白intersectin通过调控一种新型II类PI3激酶PI3KC2β来调节神经元存活；intersectin的SH3结构域与PI3KC2β氨基末端的富含脯氨酸区域相互作用；将VN标签的intersectin与VC标签的PI3KC2β共转染后，可在YFP通道中检测到荧光信号，该信号被伪彩显示为绿色，表明复合物形成。

此处将CFP伪染为红色，用作标记转染细胞的对照。PI3Kc2β脯氨酸富集区的突变会破坏intersectin与PI3Kc2β的共沉淀，从而降低BIFC信号。BIFC信号的这种差异并非源于野生型与PA型PI3K蛋白表达水平的不同。一旦掌握该技术，若操作得当，可在三天内完成。进行该实验时，需注意设置适当的对照，并检测蛋白表达情况，以确保BC信号的差异是由复合物形成差异所致，而非蛋白表达差异所致。

还可以采用表面等离子体共振等技术来研究这些复合物彼此之间的亲和力差异等问题。